1、ICS 65. 020. 30 B 44 GB 中华人民共和国国家标准G/ T 14926 . 42 - 14926.43- 2001 实验动物微生物学检测方法(1) Laboratory animal- Microbiological examination methods 2001- 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/ T 14926. 43-2001 前本标准规定了实验动物微生物学检测的染色法、培养基和试剂。在以前的相关标准中对染色法、培养基和试剂的具体内容没有进行描述，基本上是引用GB4789.4-1994(食品卫生微生物学检
2、验沙门氏菌检验、GB4789.10-1994食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验、GB4789. 11-1994 食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验和GB4789. 28-1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂中相关内容，给本标准的使用造成不便。为将染色法、培养基和试剂的配制方法和操作程序标准化并便于查找，特制定本标准。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红、黄韧、范薇。5 1.范围中华人民共和国国家标准实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂Laboratory animal- Bacteriological moni
3、toring -Staining、mediaand reagents 本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准造用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴的细菌学检测。2 原理GB/ T 14926.43- 2001 实验动物微生物从培养基中摄取营养物质，维持正常的生长繁殖和代谢，其所含细胞物质能与各种染料结合，呈现不同颜色。3 染色液的配制和染色法3.1 革兰染色法3.1.1 结晶紫染色液结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸镀水溶液80 mL 将结晶紫在乳钵内研磨，用乙醇溶解，加入草酸镀水溶液混合，即可使用。3. 1.2 映液腆1g 腆化饵2 g 蒸馆水300 mL 将腆化饵与腆先用
4、少量水溶解，待全部溶解后，加蒸馆水至300mL。3.1.3 脱色液95%乙醇3. 1.4 沙黄(番红)复染液沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL 将沙黄在乳钵内研磨，用乙醇溶解，加入蒸馆水混合，即可使用。3. 1. 5 染色法3.1.5.1 涂片风干后在火焰上固定。3. 1.5.2 滴加结晶紫染色液，染色1min.流水冲洗，甩干。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08 -29批准6 2002 - 05 -01实施GB/ T 14926.43-,-2001 3. 1. 5. 3 滴加腆液，媒染1min，流水冲洗，甩干。3. 1- 5. 4 滴加95%乙醇脱色约1
5、5-30s，流水冲洗，甩干。3.1. 5.5 滴加沙黄复红染液，染色1min，流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。3.1.6 结果使用油镜放大1000倍观察，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。3.2 姬姆萨染色法3.2.1 姬姆萨染液3. 2. 1- 1 储存液姬姆萨粉末0.5 g 甘油(中性)25 mL 甲醇25 mL 将姬姆萨粉于研钵内，先加少许甘油研磨，至甘油加完为止，倒入棕色试剂瓶中，再用少量甲醇加入研钵内，逐渐将甘油洗下，倒入试剂瓶内，直至用甲醇洗净研钵体内甘油为止。并将剩余甲醇一并加入瓶中，塞紧瓶盖，充分摇匀，置60C温箱内24h或室温一周后即可使用。3.2. .2 应用液使
6、用前储存液用pH7.2-7. 4PBS10倍稀释即成。3.2.2 染色法涂片或压印片风干后用甲蹲固定5min后滴加姬姆萨应用液，染色20-30min，用流水冲洗，甩于，风干或滤纸吸干后镜检。3. 2. 3 结果使用油镜放大1000倍观察，组织、服汁或红细胞呈红色，细菌呈紫色。3. 3 英膜染色法3. 3. 1 染色液甲醒中加入2%印度黑汁;革兰染色液中的沙黄复染液。3. 3. 2 染色法3. 3.2. 1 取一接种环肉汤培养物于载玻片上，再取一接种环甲醒印度黑汁与其混匀，推成薄片，自然干燥后火焰固定。3.3.2.2 滴加沙黄复染液，染色30s，吸去多余液体，干燥后油镜观察。3. 3. 3 结果
7、使用油镜放大1000倍观察，细菌周围有透明带者为英膜染色阳性。3. 4 支原体菌落染色法3. 4.1 染色液(Dienes染色液美兰2.5 g 刃天青(azure)1.25 g 麦芽糖10.0 g 苯甲酸0.2 g 蒸馆水100 mL 3.4.2 染色方法临用前将染色液用蒸锢水稀释100-300倍，滴加到疑似有支原体菌落的平皿中，使其铺满个平皿，不断摇动，15min后倒掉染色液，用pH7.4PBS_洗3次。3.4.3 结果平皿置解剖镜或低倍镜下观察，支原体菌落呈蓝色，L型细菌菌落在短时间内能染上蓝色，但30-60 min后褪色，呈无色。7 3. 5 乳酸酣棉蓝染色液3. 5. 1 染色液GB/
8、T 14926.43-2001 结晶酣20 g 乳酸20 mL 甘油40 mL 蒸铺水20 mL 棉蓝0.05 g 除棉蓝外，其余成分混匀后水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，然后加入棉蓝，混合均匀，必要时过滤，瓶装备用。3. 5.2 染色方法z取载玻片并加染色液数滴，用接种针(环)取培养物置于染色液中，然后加盖玻片，静置10min后，吸去周围染液，用高倍镜检查。3.5.3 结果:真菌菌体呈蓝色。3.6 鞭毛染色液3.6. 1 染色液3. 6. 1. 1 甲液:单宁酸5g.氯化高铁(FeCI3)1.5g溶于100mL蒸馆水中，待溶解后加入1%的氢氧化铀溶液1mL和15%的甲醒溶液2mL。3. 6.
9、 ,. 2 乙液:2g硝酸银溶于100mL蒸馆水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化镀溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10时，乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止.(此为关键性操作，应特别小心).滴加氢氧化镀和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用。3.6.2 染色法:在风干的载玻片上滴加甲液46mL后，用蒸馆水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒气，维持约30s(加热时注意勿使出现干燥面).在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，烘干镜检。3. 6. 3 结果:用油镜放大1000倍观察，菌体及鞭毛呈深褐色或黑色。3. 7 氢氧化梆二甲基亚飘液3.
10、7. , 成分二甲基亚枫(DMSO)40 mL 氢氧化伺1020 g 蒸馆水60 mL 3.7. 2 制法:将DMSO与蒸馆水混匀后加入氢氧化饵，置棕色瓶中备用。4 -艘培养基、选择性培养基和鉴定用培养基4. , 牛肉浸液培养基4. , . , 成分新鲜除脂牛肉氯化纳蛋白陈蒸锢水pH7. 47. 6 4. .2 制法500 g 5 g 10 g 1 000 mL 将完全除去脂肪、肌脏和筋膜的牛肉500g，加蒸馆水1000 mL.充分搅拌后置4C冰箱过夜。次日煮沸30min.并不时搅拌。用绒布或多层纱布粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在滤液中加入其他成分榕解后用氢氧化销溶液矫正pH至8.O.并煮沸1
11、0min，补充蒸馆水至1000mL.pH有明显下降时再矫正GB/ T 14926.43-2001 至7.6-7.8，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，121C灭菌15min备用，此时的pH值应该是7.4-7.6。4.2 营养肉汤4. 2.1 成分蛋白陈牛肉膏氯化饷蒸馆水pH7.4 4. 2.2 制法10 g 3 g 5 g 1000 mL 将上述成分称量混合榕解于水中，校正pH至7.4，分装中试管，每管5mL，121C灭菌15min，置4C冰箱保存，两周内用完。4.3 普通营养琼脂4. 3.1 成分营养肉汤中加入1.2%-1.5%的琼脂。4. 3.2 制法煮沸溶解琼脂后121C灭菌15m
12、in，待冷至50C左右时倾注元菌平皿，凝固后置4C冰箱保存，两周内用完。4.4 血琼脂4.4.1 成分营养琼脂中加入5%10%的脱纤维羊血。4.4. 2 制法待已灭菌的营养琼脂冷至50C左右时以无菌手续加入血液，轻轻摇匀后倾注平皿，凝固后置4C冰箱保存，一周内用完。4.5 半固体琼脂4. 5. 1 成分营养肉汤中加入0.3%的琼脂。4.5.2 制法加热煮沸，待琼脂溶化后分装小试管，每管2mL，塞上透气塞，121C灭菌15min，直立放置，冷却后4C冰箱保存，两周内用完。4.6 DHL琼脂(胆盐硫乳琼脂培养基4. 6.1 成分蛋白陈20 g 牛肉膏3 g 乳糖10 g 煎糖10 g 去氧胆酸铀硫
13、代硫酸铀拘橡酸铀水解酷蛋白拘橡酸铁镀1%中性红琼脂粉1 g 2.3 g 1 g 5 g 1 g 3 mL 15 g 9 蒸馆水pH7.4 4. 6.2 制法GB/ T 14926. 43- 2001 1 000 mL 除1%中性红溶液及琼脂外，上述成分混和，微温使溶解，调节pH值至7.4.加入琼脂，加热煮沸溶化后再加入中性红溶液，摇匀，冷至约SO-SSC时倾注平皿。凝固后放置4C冰箱保存，两周内用完。4. 7 SS琼脂4. ? 1 成分蛋白陈Sg 牛肉膏S g 乳糖10 g 胆盐(3号)3.5 g 拘橡酸铀(H2)8.5 g 硫代硫酸铀8. 5 g 拘橡酸铁镀1 g 1%中性红榕液2.5 mL
14、 0.1%亮绿溶液0.33 mL 琼脂5-20 g 蒸锢水1 000 mL pH7. 0_7. 2 4. 7. 2 制法除中性红、亮绿及琼脂外，混和其他成分，加热溶解，调节pH值，加入琼脂，加热溶化，再加入中性红和亮绿摇匀，冷至约55，._.60.C时倾注平皿。凝固后放置4C冰箱保存，一周内用完。4.8 麦康凯琼脂4.8.1 成分蛋白陈氯化铀胆盐(猪、牛等)乳糖琼脂1%中性红溶液蒸馆水pH7.2 4. 8.2 制法20 g 5 g 5 g 10 g 15,._. 20 g 5 mL 1 000 mL 将上述成分(中性红和琼脂除外)混合，加热榕解，校正pH，加入琼脂，煮沸溶化后再加入中性红溶液，
15、摇匀，.1l5C灭菌20min，待冷至50，._.5SC时倾注平皿。凝固后置4C冰箱保存，一周内使用。4.9 亚晒酸盐增菌液(SF)4.9.1 成分10 蛋白陈5 g 乳糖4g 磷酸氢二铀4. 5 g 磷酸二氢纳5. 5 g 亚砸酸氢铀蒸馆水4g 1 000 mL pH7. 07. 2 4.9.2 制法GB / T 14926 . 43- 2001 先将亚砸酸盐加到200mL蒸锢水中，充分摇匀溶解。混合其它成分，加入蒸馆水800mL，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH值(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正)。最后分装中试管，每管5mL，置水浴隔水煮沸1015min，立即冷却，4C冰箱保存
16、，一周内使用。4. 10 李氏增菌肉汤(LBLLB2)4.10.1 成分膜蛋白陈多价陈酵母浸膏氯化铀磷酸二氢梆磷酸氢二铀七叶背蒸锢水4.10.2 制法5 g 5 g 5 g 5g 1.35 g 12 g 1 g 1 000 mL 将上述成分加热溶解，调pH至7.27. 4，分装，121C15 min灭菌。LBl: 225 mL中加人1%荼陡酣酸(用0.05mol/L氢氧化纳溶液配制)0. 45 mL 1%丫脏黄(用灭菌蒸馆水配制)0.27 mL LB2: 200 mL中加入1%荼睫酣酸1%丫睫黄分装中试管，每管5mL。0.40 mL 0.50 mL 4.11 改良的McBride琼脂(MMA)
17、4. 11. 1 成分膜蛋白陈5 g 多价陈5 g 牛肉膏3 g 葡萄糖1 g 氯化纳5 g 磷酸氢二纳1 g 苯乙醇元水甘氨酸氯化钮琼脂蒸馆水pH 7. 27. 4 4. 11. 2 制法2.5 mL 10 g 0. 5 g 15 g 1 000 mL 除琼脂外混合上述成分，加热溶解，校正pH后再加入琼脂，煮沸溶化，121C灭菌15min，待冷却至5055C时倾注平皿，凝固后冷藏备用。4. 12 Cary-Blair氏运送培养基4. 12.1 成分11 GB/ T 14926.43一2001硫乙醇酸铀磷酸氢二铀氯化铀琼脂蒸馆水1%氯化钙溶液pH8.4 4. 12. 2 制法1.5 g 1.
18、1 g 5g 5 g 1 000 mL 9 mL 除氯化钙外混合其他成分，加热煮沸溶解，冷至50.C时加入氯化钙溶液，校正pH。分装中试管，每管5mL，加胶塞，121C灭菌15min。4.13 改良磷酸盐缓冲液4.1 3. 1 成分磷酸氢二铀磷酸二氢铀CNaH2PO 12H20) 氯化铀三号胆盐山梨醇蒸馆水4.13.2 制法8.23 g 1. 2g 5g 1.5 g 20 g 1 000 mL 将磷酸盐及氯化铀溶于蒸馆水中，再加入其余成分，溶解后校正pH7.6，分装中试管，每管5mL , 121C灭菌15min备用。4.14 CIN-1培养基4. 14. 1 基础培养基膜蛋白陈酵母浸膏甘露醇氯
19、化饷去氧胆酸铀硫酸镜CMgS04 7H20) 琼脂蒸锢水pH7. 4-7. 6 20 g 2 g 20 g 1 g 2g 0.01 g 12 g 950 mL 4. 14. 2 Irgasan:以95%乙醇作溶剂，溶解二苯醋，配成0.4%的溶液，待基础培养基玲至80.C时加入1 mL混匀。4.14. 3 冷至50C时加入中性红(3mg/ mU 结晶紫(0.1mg/ mU 头抱菌素(1.5mg/mL) 10 mL 10 mL 10 mL 新生霉素(0.25mg/ mL) 10 mL 最后不断搅拌着加入10mL10%氯化锯溶液，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4. 15 改良Y培养基4.15.1 成分蛋
20、白陈15 g 12 氯化锅乳糖草酸铺去氧胆酸纳三号胆盐丙嗣酸铀孟加拉红水解酶蛋白GB/ T 14926.43- 2001 5 g 10 g 2g 6 g 5g 2g 40 mg 5g 琼脂17 g 蒸锚水1 000 mL 4.15.2 制法混合上述成分，加热煮沸溶解后121C灭菌15min，冷至5055C时倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.16 葡萄糖蛋白陈琼脂(沙氏培养基4. 16.1 成分蛋白豚10 g 葡萄糖40 g 琼脂蒸馆水4.16.2制法18 g 1 000 mL 加热溶解调pH至5.6，分装大号中试管，10mL/管，1l6C灭菌30min后放成斜面，凝固后冷藏备用。4.17 皮肤癖菌
21、鉴别琼脂(DTM)4. 17.1 成分蛋白陈10 g 葡萄糖20 g 酣红(0.2%)6 mL 盐酸(0.6mol/L) 6 mL 琼脂18 g 蒸锢水1 000 mL 抗生素:氯毒素40 mg 或金每素100 mg 硫酸庆大霉素100 mg 4.17.2 制法除抗生素外，其他成分加热溶解调pH至5.5，121C灭菌15min备用。将抗生素制备成溶液后，过滤除菌，使用前临时加入。在室温中制成斜面。4.18 支原体半流体培养基4.18.1 成分含0.3%琼脂的支原体基础培养基(支原体液体培养基于粉，按使用说明书称量、并加入0.3%琼脂，配制)3.5 mL 马血清1.0 mL 酵母浸出液0.5 m
22、L 青霉素添加液0.25 mL 乙酸铠添加液0.1 mL 13 GB/ T 14926.43- 2001 4.18.2 制备方法:各种成分均需分别制备，使用时按上述比例混合。4.18.2. 1 含0.3%琼脂的支原体基础培养基:按使用说明书称量并加入琼脂，蒸馆水煮沸溶解，分装中试管，每管3.5mL.用胶塞塞紧后灭菌4C保存备用。4.18.2. 2 马血清:市售马血清经56C30min灭活后一20C保存。4.18.2.3 酵母浸出液:市售酵母浸出粉用蒸馆水配制成7%的溶液，0.22m滤膜过滤除菌，小量分装-20C保存。使用时分装小试管，每管O.60. 7 mL.用于咽及气管洗脱液的制备。4.18
23、.2.4 青霉素添加液:注射用青霉素饵盐或铀盐用灭菌蒸馆水配制成每毫升含1万U的溶液，小量分装一20C保存。4. 18. 2.5 乙酸铠添加液:乙酸铠1g溶于100mL灭菌蒸馆水中，小量分装-20C保存。4.18. 3 使用:基础培养基溶化后置50C水浴中，将马血清、青霉素添加液及乙酸钝添加液根据需要量按上述比例混合作为总添加液，取出冷至50C的基础培养基，分别加入总添加被1.35mL、用酵母浸出液制成的洗脱液0.5mL.混匀后即可培养。4.19 支原体液体培养基4.19.1 成分支原体基础培养基(干粉，按使用说明书称量、配制马血清酵母浸出液青霉素添加液3.5 mL 1. 0 mL 0.5 m
24、L 0.25 mL 乙酸铠添加液0. 1 mL 4.19.2 制法支原体基础培养基:按使用说明书称量，加入蒸馆水煮沸溶解，分装中试管，每管3.5mL，用胶塞塞紧后灭菌4C保存备用。临用时将各种成分混均即可。4.20 支原体固体培养基4.20.1 成分支原体固体培养基基础(干粉，按使用说明书称量、配制)70 mL 马血清20 mL 酵母浸出液10 mL 青霉素添加液5 mL 乙酸铠添加液2.5 mL 4.20.2 制法固体培养基基础冷至50C时加入各种添加液，混匀后倾注无菌平皿，凝固后用保鲜袋保装后置4C保存，一周内使用。4. 21 高盐甘露醇琼脂CSP)4. 21. 1 成分牛肉膏1 g 蛋白
25、陈或多价陈10 g 氧化铀75 g 甘露醇10 g 酣红0.025 g 琼脂15 g 蒸馆水1 000 mL 14 GB/ T 14926 .43- 2001 pH7.4 4. 21.2 制法除酣红和琼脂外混合上述成分，加热溶解，校正pH至7.4，加入酷红，1l5C灭菌15min，冷至5055C时倾注平皿，凝固后冷藏，两周内使用。4.22 葡萄糖肉浸液肉汤4.22.1 成分牛肉浸液培养基中加入1%葡萄糖。4.22.2 制法待葡萄糖完全溶解后先后装中试管，每管5mL，115C灭菌20min。也可用少量已灭菌的牛肉漫液溶解葡萄糖，过滤除菌后混合，摇匀，分装。4.23链球菌增菌肉汤4.23.1 成分
26、膜蛋白陈15 g 大豆陈5g 氯化铀4g 拧攘酸铀CCsHsNa307 2H20) 1 g L脱氨酸0.2 g D葡萄糖5g 亚硫酸纳0.2 g 三氮化铀0. 2 g 结晶紫0. 000 2 g 蒸馆水pH 4.23. 2 制法1000 mL 7. 37. 5 除结晶紫外，将其它成分混合，加热溶解调pH至7.37. 5，加入结晶紫，混匀，分装，经116.C，15 min高压灭菌，以无菌手续加其余成分，摇句，分装中试管，每管5mL，冷藏备用。4.24 NAC增菌液4.24. 1 成分磷酸氢二押0.3 g 硫酸镜CMgS04 7H20) 0.3 g 蛋白陈20 g 十六烧三甲基澳化镀0.2 g 荼
27、睫酣酸15 mg 蒸馆水1000 mL pH7.6 4.24. 2 制法除十六皖三甲基澳化镀外，将上述成分混合、溶解，用5mol/L氢氧化铀溶液调pH至7.47. 5 后，加入十六烧三甲基澳化镀溶解后分装中试管，每管5mL，121C灭菌1min，冷却后冷藏备用。4.25 NAC琼脂4. 25.1 成分NAC液体培养基琼脂4.25.2 制法1 000 mL 15 g 15 GB/ T 14926.43- 2001 将琼脂加入NAC液体培养基中，121C灭菌1min，冷至5055C，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4. 26 改良Camp-BAP培养基4.26. 成分4.26. ,. , 基础培养基膜蛋
28、白脏、10 g 蛋白陈、10 g 葡萄糖1 g 酵母浸膏2g 氯化锅5g 焦亚硫酸饷0.1 g 硫乙醇酸铀1.5 g 琼脂15 g 蒸馆水1000 mL 4.26.2 抗生素添加剂万古霉素0.01 g 多粘菌素B2 500 IU 两性霉素B0.002 g 头抱菌素0.015 g 4. 26.3 脱纤维羊血50mL。4. 26.2 制法混合基础培养基成分，加热溶解，校正pH至7.0，分装，121C灭菌15min，冷至50C时加入抗生素添加剂及脱纤维羊血，摇匀后倾注平皿，凝固后冷藏备用。4. 27 Skirrow氏培养基4. 27. , 成分4.27. , 基础培养基蛋白陈膜蛋白陈酵母浸膏氯化铀琼
29、脂蒸馆水15 g 5 g 5 g 5 g 12 g 1 000 mL 4.27. .2 甲氧韦氨嘈睫(TMP)、抗生素万古霉素10 mg 多粘菌素B2500 IU 甲氧节氨嘻睫(TMP)5 mg 4.27. 3 脱纤维羊血70mL。4.27.2 制法4.27.2. TMP、抗生素添加液。4. 27.2. . 乳酸62mg(约2滴加入100时，灭菌蒸馆水中，然后加入TMP100mg，煮沸。4. 27.2.1.2 取上述溶液5mL加入万古霉素和多粘菌素B，摇匀后即成。4.27. 2.2 混合基础培养基各成分加热溶解，调pH至7.2，分装，每瓶100mL , 121 oC15 min灭菌，冷藏备用。
30、临用前加热溶解，冷至50C时每100mL中加入脱纤维羊血7mL，TMP、抗生素添加液0.5mL 摇匀，倾注平皿。16 4.28 脑心浸液肉汤4.28.1 成分脑浸液干粉心浸液干粉腆蛋白陈氯化饷葡萄糖磷酸二氢铀(无水)蒸馆水pH7.4 4. 28. 2 制法GB/ T 14926 .43- 2001 12.5 g 5g 10 g 5 g 2g 2.5 g 1 000 mL 混合上述成分，加热溶解后调整pH值，分装中试管，每管5mL，使用透气塞，121C灭菌15min，冷却后冷藏，一周内使用。4.29 硫乙醇酸铀肉汤4.29.1 成分酵母浸出粉5 g 膜蛋白陈15 g 葡萄糖5.5 g 硫乙醇酸纳
31、0.5 g 氯化销25 g 刃天青0.001 g 琼脂0.5 g 蒸馆水1 000 mL pH7.2 4.29. 2 制法混合上述成分，煮沸溶解，调整pH值，分装中试管，每管5mL.使用不透气胶塞，121C灭菌15 min.冷却后冷藏，一周内使用。4.30 大豆蛋白陈肉汤4.30. 1 成分膜酶消化酶蛋白17 g 木瓜酶消化大豆粉3 g 氯化铀5 g 磷酸氢二饵2.5 g 葡萄糖2.5 g 蒸馆水1 000 mL pH7.3 4.30.2 制法混合上述成分，加热溶解，调整pH值，分装中试管，每管5mL.使用透气塞.121C 15 min灭菌，冷却后冷藏，一周内使用。5 生化培养基和血清学试)l
32、IJ5. 1 糖醇发酵培养基5. 1. 1 基础液成分17 GB/T 14926.43- 2001 牛肉膏5 g 蛋白陈10 g 氯化铀3 g 磷酸氢二铀(Na2HP03 12H20) 2 g 0.2%澳靡香草酣蓝溶液12 mL 蒸馆水1 000 mL pH7.4 5.1.2 制法在基础培养基中加入0.5%的葡萄糖、0.1%的其他糖醇，溶解后分装小试管，其中葡萄糖发酵管中倒置一个小管，115C20 min灭菌，冷却后冷藏备用。5.2 氨基酸脱殷酶试验培养基5. 2. 1 成分蛋白陈酵母浸出粉葡萄糖gbgoob EdJ噜i1.6%澳甲酣紫乙醇溶液蒸馆水1 mL 1 000 mL 0.5 g/10
33、0 mL 1 g/ 100 mL L-氨基酸或OL氨基酸pH6. 8 5.2.2 制法除氨基酸以外的成分混和，加热搭解后分装，每瓶100mL，分别加入各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸，再校正pH至6.8，同时用不加氨基酸培养基作对照。分装于灭菌的小试管内，每管3mL，并加一层液体石蜡，121C灭菌10min 。5. 3 苯丙氨酸培养基5. 3. 1 成分酵母浸膏氯化铀ubgbgb qdRunL O，L-苯丙氨酸(或L-苯丙氨酸1g) 琼脂蒸馆水磷酸氢二铀5.3.2 制法将上述成分加热溶解，分装试管，121C灭菌15min，置成斜面。5.3.3试剂10%三氧化铁溶液。5.3.4 使用方法12
34、g 1 000 mL 1 g 挑取琼脂培养物沿斜面划线接种，(36士l)C培养1824h。5.3.5 结果观察滴加10%三氯化铁溶液数滴，自斜面培养物上流下，培养物呈深绿色者为阳性。5.4 蛋白陈水(髓基质试验用5. 4.1 成分18 G/ T 14926.43- 2001 多价陈氯化纳蒸馆水pH7.4 5.4.2 制法按上述成分配制，分装小试管，121C灭菌15min，冷藏备用。5.4.3 髓基质试剂5.4. 3. 1 柯凡克试剂:将5g对二甲基氨基苯甲醒榕解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。5. 4. 3. 2 欧-波试剂:将1g对二甲基氨基苯甲醒溶解于95mL乙醇中，然后缓慢
35、加入被盐酸20mL。5. 4.4 使用方法用固体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士1)C1824h培养，必要时延长培养至3do 5.4.5 结果观察培养物中加入柯凡克试剂者，在两种潜液交界处呈红色为阳性;加入欧-波试剂者，在两种溶液交界处呈玫瑰红色为阳性。对弱阳性者可先在培养物中加入少量二甲苯，充分泪匀后再加入髓基质试剂。5. 5 缓冲葡萄糖蛋白陈水(甲基红和Vp试验用)5. 5. 1 成分磷酸氢二饵5g 多价陈7g 葡萄糖5 g 20 g 5 g 1 000 mL 蒸馆水5. 5. 2 制法混合上述成分，加热溶解后调pH7.0，分装小试管，每管12 mL，115C灭菌20min，冷却
36、后冷藏备用。1 000 mL 5. 5.3 试剂5.5. 3. 1 甲基红(MR)试剂:10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馆水。5. 5. 3. 2 v-P试剂:6%-荼酣乙醇溶液;40%氢氧化饵溶液。5.5.4 使用方法挑取琼脂培养物或三糖铁或双糖铁培养物接种，(36土l)OC培养1824h。5.5. 5 结果观察5. 5. 5. 1 甲基红试验:培养物加入甲基红试剂一滴，立即变为鲜红色为阳性，黄色为阴性。5. 5.5.2 v-P试验:培养物中加入6%-荼酣-乙醇溶液0.5mL，40%氢氧化怦溶液0.2mL，数分钟内出现红色为阳性，不变色为阴性。5. 6 尿素培养基5
37、. 6. 1 成分蛋白陈20 g 3 mL 0.4%酣红溶液氧化铀尿素葡萄糖蒸馆水5.6. 2 制法除指示剂外，用水溶解上述成分，煮沸，用1mol月，氢氧化铀溶液调节，然后加入指示剂，分装小试管，每管1 2 mL , 115 .C灭菌15min，冷却后冷藏备用。也可将除尿素外的其他成分121C灭菌15min UEgeub FbnL1 1 000 mL 19 后加入过滤除菌的尿素溶液。5. 6. 3 使用方法GB/T 14926.43-2001 用固体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士l)OC18-24h培养。5.6. 4 结果观察培养基由黄变红色为阳性。5. 7 硝酸盐培养基5.7.
38、1 成分硝酸押蛋白陈蒸锢水pH7.4 5.7. 2 制法0.2 g 5 g 1 000 mL 将上述成分溶解混匀，调pH至7.4，分装小试管，每管1-2mL, 121C灭菌15min备用。5. J. 3 硝酸盐还原试剂5.7.3.1 甲液:将0.8g对氨基苯黄酸溶解于100mL 5 mol/L乙酸溶液中。5. 7. 3. 2 乙液:将0.5g-荼胶溶解于100mL 5 mol/L乙酸溶液中。5.7. 4 使用方法用琼脂培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(36士l)C培养18-24h。5.7. 5 结果观察培养物中先加入甲液数滴，再加入乙液数滴，出现红色为阳性。5.8 氧化酶试验5. 8. 1
39、试剂1%盐酸二甲基对苯二胶水溶液，少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，一周内使用。5. 8. 2 试验方法取滤纸条粘取菌落，加氧化酶试剂一滴，30s内呈现红色至紫红色反应为阳性，于2min内不变色为阴性。注意:不能用接种针挑取菌落，只能用玻棒或竹签$对弱阳性者应同时用绿服杆菌做阳性对照，用大肠埃希菌做阴性对照。5. 9 过氧化氢酶试剂5. 9. 1 试剂3%过氧化氢溶液，临用时配制。5.9.2 试验方法用接种环挑取菌落于干净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液适量，于30s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。5. 10 克氏双糖铁(KI)5.10. 1 成分蛋白陈20 g 牛肉膏3g 酵母膏3g 乳
40、糖10 g 葡萄糖1 g 氯化铀5 g 拧攘酸铁馁。.5g 硫代硫酸铀0. 5 g 20 琼脂酣红蒸馆水pH7.4 5. 10.2 制法GB/ T 14926.43- 2001 3 g 0.025 g 1 000 mL 1昆合除琼脂和酣红的上述成分，加热溶解后校正pH。加入琼脂，溶化后再加入0.2%酣红水溶液12.5mL，摇匀，分装小试管，每管3mL，115C灭菌20min，趁热放置成高层斜面，凝固后冷藏备用。5.10.3 使用方法用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出在斜面上划线，(36土l)C培养18-24 h。5.10.4 结果观察斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖和乳糖;高
41、层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5. 11 三糖铁琼脂培养基(TSD5. 11. 1 成分蛋白脏、15 g 示陈5 g 牛肉膏5.0 g 、2. 酵母膏3. 0 g 乳糖3.0 g 庶糖10 g 葡萄糖10 g 氯化铀1. 0 g 硫酸亚铁5.0 g 硫代硫酸饷0. 2 g 酣红溶液0. 3 g 0.5%酣红溶液5 mL 琼脂12 g 蒸馆水1 000 mL pH7.4 5. 11. 2 制法将上述成分(除琼脂和酣红外)混合，加热溶解后校正pH，再加琼脂及酣红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4mL，经115C灭菌20min，
42、立即置高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。5.1 1. 3 使用方法用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出在斜面上划线，(36:1:1) C培养18-24 h。5.11.4 结果观察斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖、煎糖和乳糖;高层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解煎糖和乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5.12 乙酸铅纸条5. 12.1 制法将滤纸剪成约0.5cmX 10 cm的长条，浸泡于3%乙酸铅水溶液中，以吸干水溶液为止。将该纸条置3TC培养箱中烘干，装入试管中，121C灭菌15min。21 GB/ T 14926.43-2001 5. 12.
43、2 使用方法悬空置于已接种的双糖铁或三糖铁或SIM培养管中，(36土l).C培养18-24h。注意:勿使纸条接触培养基，否则因纸条变湿而影响结果观察。5.12.3 结果观察纸条变黑者为硫化氢阳性。5.13 SIM培养基5. 13. 1 成分膜蛋白豚多价陈硫酸铁镀硫代硫酸铀琼脂蒸懦水5.13.2 制法20 g 0.6 g 0.2 g 0.2 g 3g 1 000 mL 混匀上述成分，加热榕解，调pH7.2-7.4，分装小试管，每管2-3mL. 1210C灭菌15min，放成高层，凝固后冷藏备用。5. 13.3 使用方法用琼脂培养物穿刺接种.(36土1)C培养18-24h。5.13.4 结果观察沿
44、接种线向周围生长者为动力阳性;培养基沿接种线变黑者为硫化氢阳性;滴加哉基质试剂，在交界处出现红色者为能基质阳性(参见能基质试验)。5.14 营养明胶5. 14. 1 成分蛋白陈5 g 牛肉膏3g 明胶120 g 蒸馆水1 000 mL 5.14.2 制法混合上述成分，水浴加热溶解，校正pH7.0-7. 2.分装小试管，每管2-3mL , 121C灭菌15min，放成高层，凝固后冷藏备用。5.14.3 使用方法挑取琼脂培养物穿刺接种，(36士1)C培养18-24h。5. 14. 4 结果观察培养物放4C冰箱1h，未见凝固者为明胶液化试验阳性;凝固者为阴性。5. 15 胆汁-七叶昔培养基5.15.
45、1 成分膜蛋白陈1.5 g 七叶昔0.1 g 琼脂2g 胆汁2.5 mL 或胆盐0.3 g 拧棱酸铁0.2 g 蒸馆水100 mL 22 pH6. 46. 6 5. 15.2 制法GB/ T 14926 .43-2001 上述成分加热溶解，调pH至6.46. 6.分装试管.121C灭菌15min.放成斜面备用。5.15.3 使用方法用固体培养物沿斜面划线接种.(36土l)C培养1824h。5.15.4 结果观察培养基呈黑色者为阳性，不变色者为阴性。5.16 西蒙氏拧橡酸盐培养基5.16.1 成分氯化铀5g 硫酸镜(MgS.7H2) 0.2 g 磷酸二氢镀1 g 磷酸氢二饵1 g 拧穰酸铀5g
46、琼脂蒸馆水pH6.8 5.16.2 制法20 g 1 000 mL 先将盐类溶解于水中，再加入琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混匀后分装小试管，每管23mL. 121.C灭菌15min.趁热放置成斜面，凝固后冷藏备用。5.16.3 使用方法用固体培养物沿斜面划线接种.(36土l)C培养1824h。5.16.4 结果观察培养基由绿变蓝者为阳性，不变色者为阴性。5.17 丙二酸铀5.17.1 成分酵母浸膏1 g 硫酸镀2g 磷酸氢二饵0.6 g 磷酸二氢梆0.4 g 氯化纳2g 丙二酸铺3g 0.2%澳靡香草酣蓝溶液12 mL 蒸馆水1 000 mL pH6.8 5.17.2 制法除指示剂外，用水
47、溶解上述成分，校正pH后再加入指示剂，分装小试管，每管23mL.121C灭菌15 min.趁热放成斜面，凝固后冷藏备用。5. 17.3 使用方法用固体培养物沿斜面划线接种.(36士l)C培养1824h。5.17.4 结果观察培养基由绿变蓝者为阳性，不变色者为阴性。5.18 马尿酸锅水解试验培养基23 GB/ T 14926 .43- 2001 5. 18. 1 成分马尿酸铀肉浸液5. 18.2 制法1 g 100 mL 将马尿酸铀溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁内划一横线，121C灭菌20min备用。5.18.3试剂三氯化铁CFeC13 6Hz)1 2 g溶于2%盐酸中，总量为100m
48、L。5. 18.4 使用方法将纯培养物接种于培养基中，于42C培养48h，取出用蒸馆水补充损失水分至刻度处，1500 r / min 离心510min后，吸取上清液0.8mL，加入三氯化铁试剂0.2mL，混合均匀，静置1015min，然后观查结果。5. 18. 5 结果观察出现稳定不变的褐色沉淀为阳性。5. 19 TTC琼脂5.19. 1 成分膜蛋白陈大豆腊、葡萄糖氯化铀硫乙醇酸锅琼脂L-眈氨酸-盐酸亚硫酸纳1%氯化血红素溶液1%维生素KI溶液2，3，5-氯化三苯四氮哇CTTC)蒸馆水5.19. 2 制法17 g 3 g 6g 2. ?g !问品0.5 g 15 g 0. 35 g 0.1 g
49、 0. 5 mL 0.1 mL 0.4 g 1 000 mL 除1%氯化血红素、1%维生素Kl和TTC外，混合其他成分，加热溶解。L-胧氨酸先用少量氢氧化锅溶液榕解后加入，校正pH至7.2，然后加入1%氯化血红素、1%维生素Kl溶液，摇句，分装每瓶100 mL , 121 C灭菌15min，作为基础培养基备用.临用前每100mL中加入TTC40 mg，充分摇匀，倾注平皿，凝固后冷藏备用。5.20 1 %甘氨酸培养基5.20.1 成分膜蛋白陈10 g 蛋白陈10 g 葡萄糖1 g 酵母浸膏2 g 氯化铀5 g 焦亚硫酸铀0.1 g 硫乙醇酸铀1. 5 g 琼脂1.6 g 甘氨酸10 g 24 GB/ T
