1、ICS 65. 020. 30 B 44 G昌中华人民共和国国家标准GB/ T 14926.50,-.,14926. 55- 2001 实验动物微生物学检测方法(3)Laboratory animal- Microbiological examination methods 2001- 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局G/ T 14926.51- 2001 前本标准修订了GB/T14926. 18-1994实验动物疫酶试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主
2、要起草人:贺争鸣。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法中的免5 中华人民共和国国家标准实验动物免疫酶试验Laboratory animal- Immunoenzyme assay (IEA) 1 范围本标准规定了免疫酶试验CIEA)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。2 原理GB/ T 14926. 51 - 2001 含有病毒抗原的细胞固定于玻片上，遇相应抗体形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合，遇酶底物产生颜色反应。在普通显微镜下，根据颜色的反应判定结果。3 主要试剂与器材3. 1 试剂3. 1. 1 抗原片3. 1.
3、 1. 1 抗原片的制备将病毒接种敏感细胞(表1)，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后，用膜酶消化分散细胞，PBS洗涤三次，最后用适量PBS悬浮细胞。将细胞悬液滴于玻片孔内。同时消化不感染病毒的同批同种细胞，滴加同一玻片另一孔内，作为正常细胞对照。孔内滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜。室祖干燥后，玲丙酣(4C)固定10min。用蒸馆水漂洗后充分干燥，置于20.C备用。3. 1. 1. 2 抗原片的鉴定每批抗原片在使用前，用相应的阳性血清和阴性血清进行鉴定。鉴定方法可用IEA或免疫荧光试验。在阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应无色;阳性血清与正常细胞反应无色，而与病毒感染细胞呈棕褐
4、色，且阳性细胞数达30%50%时，此批抗原片可以使用。3. 1.2 酶结合物抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬或猴IgG抗体辣根过氧化物酶结合物用于检查相应动物的血清抗体。葡萄球菌蛋白A(SPA)辣根过氧化物酶结合物可代替抗小鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG抗体辣根过氧化物酶结合物使用。3. 1.3 阳性血清用病毒抗原免疫清洁或SPF级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级免、犬、猴所获得的抗血清;或自然感染恢复后的犬、猴血清。3. 1.4 阴性血清清洁或SPF级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或确认无相应病毒感染的兔、犬、猴血清。3. 1.5 PBS(O.Ol mol/L ,pH7. 4) 氯化纳8g 氯化饵0
5、.2 g 中华人民共和国国家质量监督检验检症总局2001-08 -29批准2002 - 05 -01实施6 磷酸二氢梆磷酸氢二铀(NazHP04 1ZHzO ) 蒸馆水3. 1. 6 底物溶液(现用现配)3，3-二胶基联苯胶盐酸盐(DAB)PBS(O. 01 mol/ L ,pH7. 4) 丙酣33%过氧化氢3. 2 器材3.2.1 普通显微镜。3.2. 2 印有1040个小孔的玻片。3. 2. 3 微量加样器，容量550L。3. 2.4 恒温水浴箱。4 操作步骤GB/ T 14926. 51- 2001 O. Z g Z. 83 g 加至1000 mL 40 mg 100 mL 5 m L
6、0. 1 mL 4. 1 取出抗原片，室温干燥后，滴加适当稀释的待检血清和阴性、阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，3TC30 m in o 4. 2 PBS洗三次，每次5min，室温干燥。4.3 滴加适当稀释的酶结合物，置f湿显盒内，3盯7。C3o mi川m儿1 0 。4.4 PBS洗3次，每次5m in 4.5 将玻片放入底物洛液中，在室温下显色51刊omin o PBS漂洗2次，再用蒸锢水漂洗1次。4.6 吹干后，在光镜下判定结果。5 结果判定在阴性、阳性对照血清成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应无色;阳性血清与正常细胞反应元色，与病毒感染细胞
7、呈棕褐色，即可判定结果。5. 1 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，判为阴性。5. 2 待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕褐色，判为阳性。根据颜色深浅可判为十+。表1IEA细胞抗原片的制备病毒敏感细胞收获时间，d病变涂片制备HV E6 710 分散细胞涂片，固LCMV Vero 710 十十定鉴定，保存Ect. BHK21 23 十+MHV DBT .L929 1-2 十十十+Sendai BHK21 24 + PVM BHK21 57 十十Reo 3 BHK21 34 + TMEV BHK21 45 +十十+MAd MK 2-4 十十十十十MVM RE , M
8、E 712 + Polyoma ME 10-12 十十十十十RCV RK 2-3 十十十十+KRV RE 7-12 十十十+-7 GB/ T 14926.51- 2001 表l(完病毒敏感细胞收获时间.d病变涂片制备H-l RE 712 +十十+分散细胞涂片，固SAll MA-I04 23 + 定鉴定，保存CDV Vero 57 + BVirus Vero 12 + SPV BHK 21 12 + 注:MK-小鼠肾细胞;ME-小鼠胚细胞;RK-大鼠肾细胞;RE-大鼠胚细胞。8 CCAVl-川HKu。F飞F、(CMHu。F飞hgu华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(3)GB/ T 14926. 5014926. 55- 2001 国中9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售* 开本880X12301/16印张1地字数39千字2002年2月第一版2002年2月第一次印刷印数1-2000 7G 定价13.00网址书号:1550 66 1- 18098 9峰595-549 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目GB/ T 14926.50-2001 H
