1、ICS 65. 020. 30 B 44 G昌中华人民共和国国家标准GB/ T 14926.50,-.,14926. 55- 2001 实验动物微生物学检测方法(3)Laboratory animal- Microbiological examination methods 2001- 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/ T 14926. 52- 2001 前本标准修订了GB/T14926.18-1994(实验动物疫荧光试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本
2、标准主要起草人:贺争鸣。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法中的免9 中华人民共和国国家标准实验动物免疫荧光试验Laboratory animal-Immunofl uorescence assay (lF A) 1 范围本标准规定了免疫荧光试验CIFA)所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。2 原理G/ T 14926. 52-2001 含有病毒抗原的细胞(组织培养细胞或动物组织细胞)固定于玻片上，遇相应抗体形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体荧光素结合物结合。荧光素在紫外光或蓝紫光的照射下，可激发出可见的荧光。因此，在荧光显微镜下以
3、荧光的有无和强弱判定结果。3 主要试剂与器材3. 1 试剂3. 1. 1 抗原片的制备将病毒接种于敏感细胞上(见表1)，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后，用膜酶消化下细胞，PBS洗涤二次，用适量PBS悬浮细胞，将细胞悬液滴于玻片孔中。同时消化未感染病毒的同批细胞，滴加同一玻片另一孔内，作为正常细胞对照。孔内滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜。室温干燥后，冷丙酣(4C)固定10min o PBS漂洗后，充分干燥，置于一20C备用。在一20C条件下可保存一年。3.1.2 羊或兔抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬或猴IgG异硫氧酸荧光素结合物，使用时用含O.01% 0.02%伊文思蓝PBS
4、稀释至适当浓度。3. 1. 3 阳性血清用病毒抗原免疫清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级兔、犬、猴所获得的抗血清;或自然感染恢复后的犬、猴血清。3. 1.4 阴性血清清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或确认元相应病毒感染的兔、犬、猴血清。3. 1. 5 PBS(O. 01 mol / L ,pH7. 4) 氯化铀氧化饵磷酸二氢梆磷酸氢二铀(Na2HP04 12HzO) 蒸馆水3. 1. 6 50%甘油PBS甘油PBS(O. 01 mol/L,pH7. 4) 8g 0.2 g 0.2 g 2.83 g 加至1000 mL 5 mL 5 mL 中华人民共和国国家质量监督检验检擅总局2
5、001-08 -29批准10 2002 - 05 -01实施3. 2 器材3. 2. 1 荧光显微镜。3. 2. 2 超净工作台。3.2. 3 低温冰箱。3. 2. 4 37C培养箱。3.2. 5 恒温水浴箱。3. 2. 6 印有1040个小孔的玻片。3.2. 7 微量加样器，容量550L。4 操作步骤GB / T 14926. 52- 2001 4. 1 取出抗原片，室温干燥后，将适当稀释的待检血清和阴性、阳性血清分别滴于抗原片上，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内.3TC3045 m in o 4. 2 PBS洗三次，每次5min.室温干燥。4.3 取适当稀释的荧光抗体，滴
6、加于抗原片上，置湿盒内.37C 3045 min。4. 4 PBS洗三次，每次5min。4. 5 50%甘油PBS封片，荧光显微镜下观察。5 结果判定在阴性、阳性对照血清成立的条件下，即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无荧光;阳性血清与正常细胞反应元荧光，与病毒感染细胞反应有荧光反应，即可判定结果。5. 1 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞均无荧光反应，判为阴性。5. 2 待检血清与正常细胞反应无荧光，与感染细胞有荧光反应，判为阳性。根据荧光反应的强弱可判定为+。表1IFA细胞抗原片的制备病毒敏感细胞收获时间，d病变涂片制备LCMV Vero 7- 10 + 分散细胞涂片，固Ect. B
7、HK21 2-3 +-十+定鉴定，保存MHV DBT ,L929 1-2 +-+ Sendai BHK21 2-3 十+-十+十PVM BHK21 5-7 + Reo3 BHK21 3-4 +-+ TMEV BHK21 4-5 +-+ MAd MK 2-4 十+-十+MVM RE ,ME 7- 12 十十十+Polyoma ME 10-12 十+-十+RCV RK 2-3 十十十+KRV RE 7-12 十+-+H-1 RE 7-12 +十十+SA l1 MA- I04 2-3 +十-+SRV Raji 10-14 +-+ SIV CM-174 10-14 +-十+STLY-1 MT-4 10
8、- 14 注:MK-小鼠肾细胞;ME-小鼠胚细胞;RK-大鼠肾细胞;RE-大鼠胚细胞。11 CCAVl-川HKu。F飞F、(CMHu。F飞hgu华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(3)GB/ T 14926. 5014926. 55- 2001 国中9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售* 开本880X12301/16印张1地字数39千字2002年2月第一版2002年2月第一次印刷印数1-2000 7G 定价13.00网址书号:1550 66 1- 18098 9峰595-549 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目GB/ T 14926.50-2001 H
