1、ICS 65. 020. 30 B 44 G昌中华人民共和国国家标准GB/ T 14926.50,-.,14926. 55- 2001 实验动物微生物学检测方法(3)Laboratory animal- Microbiological examination methods 2001- 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB / T 14926.54- 2001 前本标准修订了GB/T14926.24-1994实验动物小鼠肺炎病毒检测方法中的血凝抑制试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单
2、位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。15 中华人民共和国国家标准实验动物血凝抑制试验Laboratory animalHaemoglutination inhibition test(HAI) 1 范围本标准规定了血凝抑制试验(HAD所用试剂、器材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。2 原理GB/ T 14926. 54- 2001 某些病毒在一定的条件下，能够选择性的凝集某些动物红细胞。这种凝集红细胞的能力可被特异性抗体所抑制。3 主要试荆与器材3. 1 试剂3. 1. 1 血凝素抗原血凝抗原除部分病毒(如症类病毒)能与感染性颗粒分开外，大部分是与病毒的感染性颗粒相
3、关联，凡培养于鸡胚或组织培养中的病毒及其抗原物质，经离心除去沉淀，均可用作血凝抑制试验的血凝素抗原。见GB/T14926. 522001中表1、表2。3.1.2 红细胞悬液根据不同病毒血凝所需敏感红细胞制备悬液。一般将血液保存于阿氏搭液内，使用前pH7.4PBS 洗三次，再悬于pH7.4PBS中。3. 1. 3 阳性血清3. 1.4 阴性血清3.1.5 PBS(O. 01 mol/ L.pH7. 4) 氯化饷8g 氯化饵0.2 g 磷酸二氢梆0.2 g 磷酸氢二铀(NazHP04 12HzO) 2. 83 g 蒸馆水加至1000 mL 3.1.6 阿氏溶液葡萄糖2.05 g 拘橡酸饷0. 8
4、g 拘橡酸0. 055 g 氧化铀0.42 g 蒸馆水100 mL 115C .30 min灭菌，保存于4C。3. 2 器材中华人民共和国国家质量监督检验检疲总局2001-08 -29批准2002- 05 -01实施16 3.2.1 恒温培养箱。3.2.2 微量震荡器。3. 2. 3 微量血凝反应板(U型或V型)。GB/ T 14926. 54- 2001 3.2. 4 微量加样器(容量550L)或微量稀释棒。4 操作步骤4. 1 血凝素滴定将血凝素用PBS做连续倍比稀释，每稀释度留25L于微量血凝板孔内，再加25LPBS和50L红细胞悬液，摇匀。同时设立红细胞对照。置所需温度3060min，
5、tl定结果时将出现凝集十+的最高稀释度定为血凝素的效价。4.2 待检血清处理将被检血清置56C水浴30mn。有的血清含有非特异性抑制素，可用霍乱滤液处理，即1份血清加4份滤液，混匀后置37C水陆过夜，再置56C水浴30min。有的血清含有非特异性凝集素，可按血清体积1/10量加入50%红细胞悬液置4C16 h或室温2h，然后离心除去血球。4.3 血清稀释在微量血凝反应板(U型或V型)上，自1: 10起作一系列倍比稀释，每稀释度留25L于血凝板孔内，另取1: 10稀释的血清25L，作血清对照(见表1)。4.4 滴加血凝素在已稀释好的血清孔内(除血清对照孔外)加25L血凝素(根据血凝素不同，稀释成
6、4U或8U)。血清对照孔加25LPBS。摇均后置所需温度作用30min(见表3)。4.5 血凝素单位校对滴加血凝素的同时，将8U血凝素稀释成4U, 2U ，1U和1/2U，每孔25L，摇匀后置所需温度作用一定时间(见表2)。4.6红细胞对照加PBS50L(见表2)。4. 7 血清对照(见表2)。4. 8 滴加红细胞悬液全部试验和对照孔内，均加50L红细胞悬液，摇匀后置所需温度作用一定的时间(见表3)，判定结果。5 结果判定在对照系统(阴性血清、阳性血清、待检血清、抗原和红细胞)成立的条件下判定结果。判定时以完全不出现血凝的血清最高稀释度为血清的血凝抑制滴度。各孔血凝结果以+、+、+、+、一表示
7、。+:红细胞一片凝集，均匀铺于孔底。+:红细胞凝集基本同上，孔底有大圈。+:红细胞于孔底形成一个中等大的圈，四周有小凝块。+:红细胞于孔底形成一个小圈，四周有少许凝块。一:红细胞完全不凝集，沉于孔底。17 GB/ T 14926. 54- 2001 表l血球凝集抑制试验(检测系统)操作方法孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 稀释度1/10 1/ 10 1/20 1/40 1/ 80 1/ 160 1/320 1/640 1/ 1 2801/2560 1/512 红细胞对照待检血清，L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 血凝素，L25 25 2
8、5 25 25 25 25 25 25 25 在所需温度条件下作用一定时间PBS，L 25 50 红细胞，L50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 表2血球凝集抑制试验(对照系统)操作方法孔号2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血凝素单位4 2 1/2 PBS，L 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 血凝素，L25 25 25 25 阳性血清，L25 25 25 25 阴性血清，L25 25 25 25 红细胞，L50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 表3血凝抑制试验条件抗原抗体
9、作用加红细胞后判定阳病毒血凝单位红细胞作用温度，C性滴度备注时间，mln温度，CTMEV 8 入060 22 22 20 Sendai 4 鸡、豚鼠30 22 22 10 KRV 8 豚鼠30 22 22 20 H-1 8 豚鼠30 22 22 20 RHDV 8 入030 22 22 10 疫苗保护效果滴度CHADCPV 8 猪30 22或374 80 疫苗保护效果漓度HADICHV 4 人030 37 37 160 疫苗保护效果滴度(ELISA)RV 4 鹅120 22 4 160 疫苗保护效果滴度也LISA)18 CCAVl-川HKu。F飞F、(CMHu。F飞hgu华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(3)GB/ T 14926. 5014926. 55- 2001 国中9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售* 开本880X12301/16印张1地字数39千字2002年2月第一版2002年2月第一次印刷印数1-2000 7G 定价13.00网址书号:1550 66 1- 18098 9峰595-549 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目GB/ T 14926.50-2001 H
