1、ICS 65. 020. 30 B 44 GB 中华人民共和国国家标准dEE 4llnHU 4lnunu nunuL nHUn/一ny一?-7AH户hv41t户。户hv户hu4l，nJ内/n/nuvnudnudnHdnHUanME A斗A斗nt叮lAEE,ABEt-JV 干中4E，nRUAAAA吁户hu户hunkuphunJn/nJnJ nudn叫JvnHdnwdAH.an-AAAAIda-aESEAt-,AEE TTTT JffJ/fJ/JIf BBBB GGGG 实验动物微生物学检测方法(2)Laboratory animal一-Microbiological examination -m
2、ethods 2001 - 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局发布GB/ T 14926. 8- 2001 前本标准是对GB/T14926.8-1994(实验动物肺支原体检验方法的修订。本标准取消了用于支原体种鉴定的生长抑制试验，将盲传次数减至1次，增加了ELISA法作为初步检测的选用方法。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红。本标准于1994年1月首次发布。25 中华人民共和国国家标准实验动物支原体检测方法Laboratory animal-Method for examinat
3、ion of Mycoplasma sp. 1 范围本标准规定了实验动物支原体的检测方法。本标准适用于小鼠、大鼠的支原体检测。2 引用标准GB/ T 14926.8- 2001 代替GB/T14926. 8-1994 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/ T 14926.42-2001 实验动物细菌学检测标本采集GB/T 14926.43- 2001 实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T 14926.50-2001 实验动物酶联免疫吸附试验3 原理对
4、实验动物具有致病能力的支原体主要寄居其上呼吸道，支原体在半流体培养基和固体培养基上可形成特殊菌落，菌落可被Dienes染色液染成蓝色而不褪色，据此可进行病原学鉴定。动物感染支原体后血清中可产生相应抗体，使用ELISA法可进行抗体检测，但由于动物自然感染后血清抗体水平较低，亦有可能因与其他病原微生物存在共同抗原而导致的交叉反应，故血清学方法仅作为初步检测的选用方法。4 主要设备和材料4. 1 普通恒温培养箱。4.2 实体显微镜。4.3 蜗旋混匀器。4. 4 毛细吸管，每份样品1支。4.5 恒温水浴箱。4.6 高速离心机。4. 7 超声波细胞粉碎器。4.8 酶标仪。4.9 聚苯乙烯板，40孔、55
5、孔或96孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，紫外光照射1h。4.10 微量加样器，容量550L和50200L。5 培养基和试荆5. 1 支原体半流体培养基。申华人民共和国国家质量监督检验检度总局2001-08 -29批准2002 - 05 -01实施26 5. 2 支原体液体培养基。5.3 支原体固体培养基。5.4 Dienes染色液。5.5 ELISA抗原GB/ T 14926. 8- 2001 5.5.1 支原体培养:肺支原体、关节支原体和溶神经支原体标准株接种支原体液体培养基，36C摇动培养23d。5.5. 2 己明显温浊的培养液按8000 r/min离心30min，沉淀用PBS在相同条件
6、下洗3次。5.5.3 上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，上清即为ELISA抗原。5.6 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体，用于检测相应动物血清抗体;辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白ACSPA)，用于检测小鼠血清抗体。5. 7 阳性血清支原体抗原免疫清洁级或SPF级小鼠或大鼠所获得的抗血清。5.8 阴性血清无支原体感染的清洁级或SPF级小鼠和大鼠血清。5. 9 其他试剂溶液的配制见GB/T14926.49-2001。6 检测方法6. 1 分离培养法6. 1. 1 检测程序27 G/ T 14926. 8- 2001 菌落形态。-n口。回氏染色6.1 . 2 操作步骤6.1.
7、2. 1 采样取包括咽部及以下气管约510mm左右放入装有o.60. 7 mL酵母浸液的试管中，用蜗旋混匀器制成洗脱液。6.1 . 2. 2 分离培养按GB/T14926. 42-2001 4.18进行接种后放(36土l)C培养箱培养。6. ,. 2. 3 鉴定a)支原体在半流体培养基中经37d培养，在培养基的上部可形成小的慧星状、云雾状或沙粒状菌落。b)吸取含可疑菌落的半流体培养物约0.5mL转种支原体液体培养基，(36土l)C培养57d，吸取该培养物约0.1mL接种于支原体固体培养基，用L棒涂抹均匀，待表面干后将培养基放入保鲜袋，28 GB/ T 14926.8- 2001 密闭，(36土
8、l)C培养。c)支原体在固体培养基培养37d后可形成煎蛋状或杨莓状菌落。d)染色:将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，30min或更长时间后支原体菌落依然为蓝色，而细菌L型菌落则变为无色。e)如初代半流体培养7d无可疑菌落出现，应吸取约1/10的初代培养基接种于相同培养基进行盲传，经(36土l)OC培养7d，如仍无可疑菌落出现则判定为阴性;对出现可疑菌落者则按照b)、c)、d)步骤进行鉴定。6.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)6. 2.1 包被抗原根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。每孔100L，置37C1 h后再4C过夜。6.2.2 用洗涤液洗5次，每次3min，叩干
9、。6.2.3 加样待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1: 40稀释，每孔100L，37C1 h，洗涤同上。6.2.4 加酶结合物用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入100L，37C1 h，洗海同上。6.2.5 加底物溶液每孔加入新配制的底物溶液100L，置3rc，避光显色1015min。6.2.6 终止反应每孔加人终止液50L。6.2.7测A值在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。6.2.8 结果判定在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。6.2. 8.1 同时符合下列2个条件者，判为阳性。a)待检血清的A值;?:O.2; b)待检血清的A值/阴性对照血清的A值注2.10
10、6.2.8.2 均不符合上述2个条件者，判为阴性。6. 2. 8.3 仅有1条符合者，判为可疑，需重试。6.2. 8.4 对阳性结果需重试，如为阳性则判为阳性。7 结果报告ELISA法结果阳性者应抽取相同动物群动物进行支原体分离培养，符合上述培养、染色特征者作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。29 FCON-导.N叮!叮叮.Nm叮CON-5.N叮俨问筒。OONi止.N叮!.N叮FCON-.N白叮!二N叮俨同阁。同阁。同阁。华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(2)GB/T 14926.1-14926.6-2001 GB/T 14926.8-14926.17 2001 国中GB/T 14926.41-2叫01GB/T 14926.44-14926.49 2001 中国标准出版社出版北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码:100045电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68517548 普* 印张6字数180千字2002年2月第一次印刷开本880X12301/16 2002年2月第一版印数1-2000峰7巳定价45.00网址书号:155066 1-18097 也略595-547 版权专有侵权必究举报电话;(010)68533533科目GB/T 14926. 1-2001 H
