1、ICS 65150B 51 a亘中华人民共和国国家标准GBT 1510112008代替GBT 151011一19942008-04-09发布中国对虾 亲虾Chinese shrimp-Parent shrimp2008-06-0 1实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1”刖 吾GBT 15101(中国对虾分为两个部分：GBT 151011 2008 中国对虾亲虾；GBT 151012 2008 中国对虾苗种。本部分为GBT 15101的第1部分。本部分代替GBT 151011 1994中国对虾养殖亲虾，主要变化如下原标准名称中国对虾养殖亲虾改为中国对虾亲虾；增加了关于运输的要求
2、；增加了关于检疫的要求；增加了抽样原则、组批、抽样方法的内容；一增加了资料性附录“中国对虾性腺发育”(见附录A)；增加了规范性附录“自斑病病毒的检疫”(见附录B)。本部分的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。本部分主要起草人：张岩、陈四清、于东祥、李鲁晶。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 151011 1994。GBT 1510112008中国对虾亲虾GBT 15101120081范围6BT 15101的本部分规定了中国对虾(Fenner
3、openaeus chinensis)亲虾的来源、质量要求、检验方法、检验规则和运输要求。本部分适用于中国对虾亲虾的培育、销售和使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15101的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。NY 5052无公害食品 海水养殖用水水质3术语和定义下列术语和定义适用于GBT 15101的本部分。31亲虾parent shrimp中国对虾人工苗种繁育期间所使用的已交尾的
4、中国对虾的雌虾。4质量要求41亲虾来源411从自然海区捕获的或从人工养殖池塘中选育的中国对虾亲虾。412发生过病毒病的虾池的剩余虾不得用作亲虾。413鼓励使用原、良种场提供的优质亲虾。42外观421形态特征虾体完整，体色鲜明正常，体质健壮，头胸甲、腹节、附肢及尾扇完好无伤，额角完整无折断，无其他外伤、无畸形，符合中国对虾形态分类特征。422体色色泽鲜艳，呈自然的虾青色。423体表体表光洁，无附着物。424活力对外界刺激反应灵敏，手抓挣扎有力，游动正常，不游动时正向匍匐水底，不侧卧。425病症无褐斑、黑鳃、红腿、烂眼、软壳、白斑、白黑斑等病症。43规格431体长人工养殖亲虾不小于14 c“；自然
5、海区捕获的亲虾不小于17 cm。1GBT 1510112008432体重人工养殖亲虾不小于28 g；自然海区捕获的亲虾不小于58 g。44交尾及性腺发育纳精囊饱满微凸，内有乳白色的精荚；卵巢发育良好，轮廓清晰，呈灰绿或墨绿色，颜色与发育阶段相符，亲虾卵巢发育分期情况参见附录A。45检疫亲虾在人池前应进行白斑病的检疫，带病毒的虾不得用作亲虾。5检验方法51外观用肉眼按照42的要求进行检查。52规格521体长当虾体自然伸展时，用直尺(精度l mm)测量从眼柄基部至尾节末端的长度。522体重用湿纱布将亲虾体表水分吸干后，用天平(感量为01 g)称重。53检疫白斑病病毒的检疫见附录B。6检验规则61抽
6、样原则抽样按照62、63的规定进行，外观、规格、体重的检验采取抽样和目测结合的方法。62组批海捕亲虾以同一来源、同一时间捕获的为同一检验批。人工养殖对虾以同一养殖池的为同一检验批。63抽样方法同一检验批的亲虾应随机取样，批量在1 000尾以下(含1 000尾)的，取样数为批量的2，最小取样数为lo尾；批量在1 000尾以上，5 000尾以下(含5 000尾)的，取样数为批量的1；批量在5 000尾以上的，取样数为批量的05。64检验结果的判定所有抽检亲虾应符合第4章的要求，不符合要求的亲虾即判定为批不合格。7亲虾的运输71 亲虾应尽量做到随捕随运，尽量缩短运输前的暂养时间。72亲虾的运输方式可
7、采用帆布桶运输、塑料袋充氧运输(塑料袋中加入10 L海水置3尾5尾亲虾，充人氧气至15 L20 L扎紧即可运输)或活水船、活水车运输，运输过程中可保持充气或中途换水，应保持水中溶解氧含量在5 mgL以上。73应根据距离、密度、水体大小等确定亲虾运输密度，一般为50尾m280尾m2。74亲虾运输用水应符合NY 5052的要求。75亲虾运输过程中应防晒、防雨淋，天冷运输应注意保温。2中国对虾的性腺发育大体可分为六期第1期附录A(资料性附录)中国对虾性腺发育GBT 1510112008雌虾在交配前性腺纤细，透明无色，外观看不到性腺，卵细胞很小，其内物质稀薄，核大圆形。第期交配过后，解剖可见性腺呈半透
8、明，白浊或带淡灰色。体积稍有增大，呈粗线条状，但卵细胞尚未有卵黄粒，核大，核仁数量多，散布于核内，外观仍看不到卵巢的形状和色泽。第期外观可以看到，性腺呈淡绿色，体积明显增大，卵巢内的卵细胞出现有卵粒。第期卵巢基本达到最大体积，充满虾体的头胸部及体腔，呈深绿色或灰绿色。卵细胞的周围出现短棒状的周边体。卵黄颗粒大，核仁分裂成小点状，数量增多，散布于核的周围。滤泡细胞变薄。营养物质被卵细胞所吸收。第V期卵巢达到最大的丰满度，呈褐绿色。卵巢背面棕色斑点增多，表面龟裂突起。卵粒清晰。卵细胞内核膜消失，核仁溶解，周边体明显增长，呈辐射状排列于卵的周围。滤泡膜被吸收而不再存在。第期已产过卵。卵巢萎缩，外观为
9、土黄色，看不清卵巢的轮廓。3GBT 1510112008附录B(规范性附录)白斑病病毒的检疫B1 DNA的提取a)活体或冰冻的成虾鳃或胃(游泳足或步足也可以)样品约5 mg100 mg，活体或冰冻幼体、仔虾及幼虾个体样品约5 mg100 mg(去掉幼虾眼)，将所取所有样品剪碎后混合均匀，取5 mg100 mg放人灭菌15 mL微型离心管中，加入抽提缓冲液500“L，用研磨棒充分研磨，37温浴1 h。b)加入25“L 20 mgmL蛋白酶K，至终浓度100 tLgmL，混匀后置于50水浴3 h，不时旋动。c)将溶液冷却至室温，分别用等体积平衡酚、酚一三氯甲烷一异戊醇、三氯甲烷一异戊醇(24：1)
10、，颠倒混合10 min，抽提，于10 000 rmin离心1 min3 rain分离两相，保留水相。d)水相移至一新灭菌微型离心管中，加人100 tLL 10 molL乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(一20)混匀，一20放置2 h，10 000 rrain离心10 rain，弃上清液。e)用70乙醇洗涤沉淀2次，每次i0 000 rrain离心5 rain，小心倾去上清液，最后沉淀于室温晾干。f) 沉淀晾干后加入100“L灭菌双蒸水或100 FL TE缓冲液溶解DNA并保存于一20。C。B2第一步PCR操作引物序列F1：5一AcTACT AAc_TTcAGc-cTA-TCT-AG
11、3，R1：5一TAA-TGCGGC-TGT-AATGTTCTTAcGA一3 7，反应体系见表B1。按以下程序进行扩增：90C预热2 rain，离心1 s2 S，然后94(2 4 rain、551 min、722 rain，1个循环；941 rain、551 rain、72C 2 rain，39个循环；72延伸5 rain。4保温。表B1 白斑病病毒检疫第一步PCR反应体系试 剂 用 量 终浓度10PCR缓冲液(无M92+) 25 pL 1PCR缓冲液MgCl2(25 mmolL) 15tJL 15 mmolLdNTP(10 retoolL) 0，5”L 200molLDNA横版 1 pL10t
12、LmolL引物Fl 25“L 1且molL10tlmolL引物Rl 25 uL 1 pmolLTaq DNA聚合酶(5 Ut,L) 01 gL 002 UiLL灭菌双蒸水 144“L预混物总体积 25 uLB3第二步PCR操作第二步PCR反应体系见表B2，PCR循环同B2。4表B2 白斑病病毒检疫第二步PCR反应体系GBT 1510112008试 剂 用 量 终浓度10PCR缓冲液(无M92+) 25zL 1PCR缓冲液MgCl2(25 mmolL) 15 uL 15 mmolLdNTP(10 mmolL) 05zL 200 pmolL10zmolL引物F2 25zL 1LmolL101mol
13、L引物R2 25 uL 1 pmolL10molL引物F3 25zL 11molL10JmolL引物R3 25xL 1 HmolL灭菌双蒸水 79“LTaq DNA聚合酶(5 UffL) 01zL 002 U“L第一步PCR反应产物 25 uL预混物总体积 25 uLB4扩增产物的电泳采用15的琼脂糖凝胶，点样量为10“L第二步PCR反应产物与2ffL 6载样缓冲液，在另外的泳道分别加入5“L 1 kb DNA分子质量标准的载样混合物和阳性对照、阴性对照、空白对照，在1 Vcm5 Vcm的电压下电泳约1 h，当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1223处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪上观察或照相。注1：阳性对照为已知受WSSV(对虾白斑病病毒)感染且PCR结果显示明显阳性结果的WSSV DNA模板，一20保存。注2：阴性对照为已知未受WSSV感染且PCR结果显示阴性结果的对虾组织DNA模板，一20保存。注3：空白对照以无菌双蒸水为模板。B5结果判定阳性对照在941 bp处会有一条特定条带出现；阳性样品在941 bp和848 bp处会有特定条带出现；阴性对照和阴性样品只在848 bp处有条带；无菌水为模板设立的空白对照不出现任何条带。阳性对照在941 bp处无特定条带出现或阴性对照在941 bp处有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。
