1、ICS 65150B 51 酋雪中华人民共和国国家标准GBT 1510122008代替GBT 151012-19942008-04-09发布中国对虾 苗种Chinese shrimp-Seedings2008-06-0 1实施宰瞀粥鬻瓣訾矬瞥翼发布中国国家标准化管理委员会促11刖 昌GBT 15101中国对虾分为两个部分：OBT 151011 2008中国对虾亲虾；GBT 1510122008中国对虾苗种。本部分为GBT 15101的第2部分。本部分代替GBT 151012一1994中国对虾养殖苗种，主要变化如下一一原标准名称中国对虾养殖苗种改为中国对虾苗种；增加了术语对应的英文；删除了弱苗率
2、的定义和要求；一苗种规格的最低限由07 cm修改为08 cm；增加了对苗种来源的要求；增加了虾苗计数方法的内容；一r增加了对主要病毒性疾病的检疫要求；增加了苗种运输的内容；一增加了规范性附录“涛拉综合症的检疫”(见附录A)；增加了资料性附录“RNA的实验室操作要求”(见附录B)。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。本部分主要起草人：张岩、陈四清、于东祥、李鲁晶。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：一GBT 151012 1994GBT 15
3、101220081范围中国对虾苗种GBT 1510122008GBT 15101的本部分规定了中国对虾(FeM8ropPnnP“5 chinensis)苗种的规格、质量要求、检验方法、检验规则和运输方法。本部分适用于中国对虾苗种的生产、销售和使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15101的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 1510112008中国对虾亲虾NY 5052无公害食
4、品 海水养殖用水水质3术语和定义下列术语和定义适用于GBT 15101的本部分。31规格合格率size qualified rate符合规格要求的苗种数占苗种总数的百分比。32体色异常率abnormal body-eolour rate体色异常(如发白、发红、腹部色素细胞异常扩张等)苗种数占苗种总数的百分比。33伤残率wound and deformity rate发育畸形或附肢和额角损伤的苗种数占苗种总数的百分比。34带病率illness seeding rate患有能现场判别病症或附着有其他附着物的苗种数占苗种总数的百分比。35死亡率death rate死亡的个体数占苗种总数的百分比。4苗
5、种质量要求41苗种来源由符合6BT 151011 2008规定的中国对虾亲虾繁殖培育的苗种，苗种体长不小于08 cm。42各项指标要求421外观虾苗应规格整齐，体色正常，体表光滑，健壮、活力强，舀起后迅速伏底，搅动后有明显的顶流现象。422质量要求苗种质量应符合表1各项指标的要求。GBT 1510122008表1 中国对虾苗种质量要求序号 项目 指标1 规格合格率 952 体色异常率 13 伤残率 14 带病率 15 死亡率 0036 对虾白斑病毒(WSSV) 不得检出7 涛拉综合症病毒(TSV) 不得检出43苗种的检疫应对苗种进行对虾白斑病(WSSV)、涛拉综合症(TSV)检疫。5虾苗计数方
6、法51带水容量法将虾苗盛于已知容量的容器内，充分搅拌使虾苗分布均匀，用100 mL200 mL的容器量取虾苗，逐尾进行计数，重复2次，计算3次的算术平均值，根据水体之比，算出整个容器中虾苗总数。52无水容量法又称于量法，用塑料纱网或尼龙筛绢制成杯状漏斗容器，或用不锈钢薄板制成半圆形杯状漏斗瓢，用此杯捞取集苗箱内的虾苗，逐尾进行计数，重复2次，计算每杯的算术平均值，按杯数计算出虾苗总数。53重量计数法用尼龙筛绢网袋捞取集苗箱内的虾苗，滴水05 min称其重量，重复3次，计算出每千克或每克虾苗的尾数。6检验方法61规格合格率测定直接用直尺(精度1 mm)测量虾苗从眼柄基部至尾节末端的长度，每次取样
7、数不得低于30尾。62体色异常率、死亡率、伤残率、带病率活体直接观察，测死亡率每次取样数不得低于10 000尾，测体色异常率、伤残率、带病率每次取样数不得低于1 000尾。63对虾白斑病的检疫对虾白斑病病毒的检疫见GBT 151011 2008附录B的规定。64涛拉综合症的检疫涛拉综合症的检疫见附录A。7检验规则71组批以一个育苗池为一个检验批，销售前按批检验。72取样方法每个检验项目随机取样3次，取3次结果的算术平均值。73判定规则按第4章规定的各项指标判定苗种是否合格，有一项不达标即判定为批不合格。2GBT 15101220088苗种的运输81 苗种运输可采取帆布桶充气运输、塑料袋充氧运输
8、。82气温20C左右，用帆布桶运输体长10 Oil215 cm的虾苗，运输密度可在15万尾m325万尾m3；规格30 cmX 30 cm75 cm的塑料袋充氧运输，在水温20C24时，每袋装水四分之一，可运输08 cm10 cm的虾苗25万尾3万尾，运输时间20 h以内，成活率在90以上。83运输用水与苗种培育用水的温差应小于3，盐度差小于3。84运输应尽量在早晚进行，避免阳光曝晒和雨淋。85运输用水应符合NY 5052的要求。3CBT 1510122008附录A(规范性附录)涛拉综合症的检疫A1实验室操作要求进行涛拉综合症检疫的实验室操作应满足附录B的要求。A2 RNA模板的提取a)b)c)
9、d)e)f)g)h)按不同大小的虾苗或感染期取不同组织样品01 g左右，其中，对虾幼体、仔虾取完整个体，3 cm以下的幼虾取摘除虾眼的头胸部，较大的幼虾可取鳃区或数根鳃丝，怀疑为慢性期感染的较大幼虾或成虾取对虾的淋巴器官。样品可暂时保存于一20。所取样品在0。C以下研磨混合均匀，取01 g05 g置于15 mL无菌微量离心管中，加入05 mL1 mL Trizol“试剂，用研磨棒研磨，然后置室温5 min。加入02 mL三氯甲烷，振摇混合1 5 s，室温放置3 min。于10 000 rrain离心5 rain。仔细吸取上层水相，移至一支无RNA酶的微量离心管中。加05mL异丙醇，混匀，置室温
10、10rain。10 000 rrain离心10 rain，倒去上清液。加人1 mL无RNA酶的70乙醇，振摇1 min，再于10 000 rrain离心3 rain，小心倒去上清液。i) 敞口颠倒离心管，于室温晾干沉淀，加入20 pL100 pL无RNA酶的水溶解RNA沉淀，立即用于RTPCR或保存于一70C待用。A3 RT-PCR扩增F1引物序列如下：5_TCAATpAGA-GCTTGCrTCC-3。反应体系按照表A1的规定，扩增程序如下：60。C保温5 rain，快速取出并短暂离心，继续在60C保温30 min进行逆转录反应，然后942 min，再按94C 45 s、6045 s，40个循
11、环；607 rain，最后4保温，PCR产物的电泳参照GBT 1510112008中B4进行。袭A1 涛拉综合症RT-PCR扩增体系试剂 用量 终浓度5xEZ缓冲液 5 pL 1EZ缓冲液醋酸锰(25 retoolL) 25 uL 25 mmolLdNTP(10 retoolL) 075LL 300 pmolL10“molL引物F1 115“L 046“molL10 pmolL引物R1 115 uL 046 pmolL无RNA酶的水 1345 uLrTth DNA聚合酶(5 UpL) 05 uL 01 UI,LRNA模板 05 uL反应总体积 245 uL4GBT 1510122008A4结果
12、判定A41阳性对照在213 bp处会有一条特定条带出现；阴性对照在213 bp处不出现条带，以无菌水为模板设立的空白对照不出现任何条带。阳性对照在213 bp处无特定条带出现或阴性对照在213 bp处有条带出现都表明RT-PCR失败。注1：阳性对照为已知受TsV感染且RT-PCR结果显示明显阳性的样品RNA模板，70保存。注2：阴性对照为已知未受TsV感染且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织RNA模板，-70保存。注3：空白对照为无RNA酶的水作模板。A42条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。A43样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读。在213 bp有条带出
13、现表示样品检测结果为阳性，在213 bp无条带出现表示样品检测结果为阴性。A44阳性结果表明被检样品中存在TsvRNA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受TSV感染。GBT 1510122008B1一般介绍附录B(资料性附录)RNA的实验室操作要求在RNA操作过程中，应注意RNA酶的活性。由于RNA很容易被RNA酶降解，而RNA酶又具有很强的稳定性，且广泛存在，因此在操作中要严格防止RNA酶污染，并设法抑制其活性。RNA酶的污染包括内源性的和外源性的。内源性的RNA酶污染是指来自于样品组织本身的RNA酶或生化试剂本身的RNA酶。消除方法主要是在RNA抽提和操作过程中使用RNA酶变性剂，如用异硫氰酸
14、胍、酚、三氯甲烷等抽提使RNA酶变性灭活；使用RNA酶抑制剂，如RNasin使RNA酶的活性受到抑制。外源性的RNA酶污染是指来自于水、玻璃制品、塑料器皿、电泳槽、操作人员和微生物等。可通过焦乙酸二乙酯(DEPC)、三氯甲烷、干热烘烤等消除。本附录主要介绍外源性RNA酶的消除方法。注意：DEPC、酚和胍盐等有毒或有腐蚀性，应避免吸入、吞食和沾着皮肤，处理DEPC和三氯甲烷的操作均应在通风橱内进行。B2溶液配制直接用于RNA操作的所有水或无机盐溶液都应加入DEPC至01，搅拌12 h，然后经高压蒸汽灭菌15 min。不能用DEPC处理的试剂(如含有Tris的溶液)或者不能经高压蒸汽灭菌的试剂，应
15、用经DEPC处理的水配制，然后经无RNA酶的022zm微孔滤膜过滤除菌。B3玻璃制品玻璃器皿洗净后，在300烘烤4 h可彻底除去器皿上沾污的RNA酶。由于烘烤温度高，不能用任何在300下可燃烧、变性或融化的材料包裹器皿。金属制品也可按玻璃制品的办法处理。B4聚丙烯塑料制品聚丙烯塑料制品可在通风橱内用三氯甲烷漂洗，晾干后再经高压蒸汽灭菌，最后烘干。也可在加有01DEPC水中浸泡12 h，然后经高压蒸汽灭菌，最后烘于。无RNA酶的一次性塑料制品，如塑料离心管、PCR管、枪头等也可购买直接使用。B5电泳槽许多电泳槽由有机玻璃或聚苯乙烯材料制成，不能用三氯甲烷处理，也不能经高压蒸汽灭菌。可用去污剂洗涤，水冲洗后用乙醇干燥，再浸泡于3H。O。中，室温下放置10 rain，然后用含01NDEPC的水冲洗电泳槽，晾干并做上标记，供RNA专用。RNA经过RTPCR后，产物已变成DNA，电泳时并不需要对其电泳槽进行无RNA酶处理。B6人工操作处理RNA的全部操作应戴塑料或乳胶的一次性手套，同时应避免因交谈或其他活动造成的飞沫、落尘带入RNA酶的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在超净台中进行操作。B7防微生物污染所有接触RNA的试剂和材料都应保持无菌，一旦有微生物污染或生长都应丢弃。
