1、中华人民共和国国家标准事L饮料中菌的微生物学检验GB/T 16347-1996 Mlcroblologlcal examlnatlon of I actlc acld bacterla In yogburt beverage 1 主题内容与适用范围本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。2 引用标准GB 4789. 28.食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 术语乳酸菌g一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。乳酸菌菌落总
2、数:检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸茵茵落的总数。4 设备和材料4. 1 温箱:36:l:1C。4.2 冰箱:0-4C，4.3 恒温水浴:46士lC。4. 4 电炉g可调式。4.5 吸管:容量为1.10和25mL, 4.6 广口瓶或一角瓶z容量为500mL, 4. 7平皿g直径为9cmc4.8试管:18X180mm, 4.9 显微镜。5培费基和试J5. 1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。5.2 改良MC培养基(ModifiedChalmers培养基)。5. 3 o. 1 %美兰牛乳培养基。5.4 6. 5 %氯化锅肉汤。5. 5 pH9. 6葡萄糖肉汤。5.6 40
3、%胆汁肉汤。5. 7 淀粉水解培养基。中华人民共和国卫生部1996-06-19批准374 1996-09-01实施5.8 精氨酸水解培养基。5.9乳酸杆菌糖发醇管。5.10 七叶脊培养基。GB/T 1634 7 1996 5. 11 革兰氏染色液s按GB4789. 28规定执行。5.12 3%过氧化氢溶液z按GB4789. 28规定执行。5.13 蛋白陈水、自童基质试剂s按GB4789. 28规定执行。5.14 明胶培养基z按GB4789. 28规定执行。5.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂g按GB4789.28规定执行。5. 16 生理盐水z定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。6 乳酸菌菌落总数的
4、测定6. 1 检验程序乳酸菌菌落总数检验程序如下:6.2 操作步骤检样! 作成几个适当倍数的稀释液选择23个适当稀释度，各以1mL 之量加入灭菌平皿内+ 每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基36土1.Ct 72士3h 菌落计数+ 报告6. 2. 1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1I 10的均匀稀释液。6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1I 10稀释液1mL.沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。6.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增次，即换用1
5、支1mL 灭商吸管。6.2.4 选择23个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50.C的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL.并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内375 GB/T 1 634 7 - 1 996 完成。6.2.6待琼腊凝固后，翻转平板，置36土lC温箱内培养72土3h取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1).
6、选取菌落数在30-300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氮酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数.例如，检样10寸的稀释液在改良TA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为235flh2似町6. 3 乳酸菌在改良TA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。表l乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良TJA改良MC杆菌平皿底为黄色，菌黯中等大小，徽白色，湿润，边缘平皿底为粉红色，菌落较小
7、，圆形，红色，边不整齐，直径3:!:1 mm，如棉囊团状菌落缘似星状，直径2:!:1 mm.可有淡淡的晕球菌平皿鹿为黄笆，菌落光滑，湿润，徽臼鱼，边缘整齐平皿底为粉红色，商落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕注2干酶乳杆商在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状.7 乳E童菌的鉴定对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。7. 1 菌种制备s自平板上挑取菌落，接种于改良TA或改良MC琼脂斜面，于36士lC.24-48 h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。?2 乳酸杆菌鉴定试验z极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生自童基质和硫化氢。7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合
8、物反应，见表2。7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表30表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应七叶苦纤维工糖麦芽糖甘露醇水杨普山梨醇干酷乳杆菌十+ d 十+ + 干酣亚种保加利亚乳抨菌嗜酸乳杆菌+ + + + 乳酸乳杆菌享享+ 注，d有些菌株阳性，有些菌株阴性，就一一弱、慢或阴性.376 煎糖d 十+ GB/T 16347一1996表3产乳酸的链球菌的鉴别表生长试验加热60(;水解水解0.1% 6.5% 40% pH 30 min 淀粉精氨酸10.C 45(; 美兰牛乳氯化销胆汁9. 6 嘈热链球菌+ 十+ 乳链球菌+ + + d + 乳脂链球菌+ d + d 注，d 有些商株阳性.有些菌株阴
9、性.377 GB/T 16347-1996 附录A数种专用培养基及试lIJ(补充件)A1 改良TJAt章基(改良番茄汁琼脂培弊基)A 1.1 成分番茄汁50 mL 酵母拍摄液5g 肉膏10 g 军L糖20 g 葡萄糖2g k,HPO, Zg 吐温801 g 乙酸销5 g 琼脂15 g 水力日至1000 mL pH6. 8土O.2 A 1.2 制法番茄汁的制作:将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎).放入三角烧瓶，置4C冰箱8-12h.取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入。冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。制法:将所有成分加入蒸馆水中，加热溶解，校正pH6.8土O.Z 0分装
10、烧瓶，高压灭菌121C15-20 min, I脑用时加热熔化琼脂，冷至50C时使用。A2改良MC培弊基A2. 1 成分大豆蛋白陈5 g 牛肉浸膏5 g 酵母浸膏5 g 葡萄糖20 g 乳糖20 g 碳酸钙10 g 琼脂15 g 蒸饱水1 000 mL 1%中性红溶液5 mL 硫酸多帖菌素B(酌情而加)10万国际单位A2.2 制法将前面7种成分加入蒸饱水中，加热溶解，校正pH6.加入中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121C 15-20 min，临用时加热熔化琼脂，冷至50C.酌情加或不加硫酸多粘菌素BC检样有胖听或开罐后有异味等怀疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B.混匀后使用)。A3 0.1%羹兰牛草
11、L培弊基新鲜脱脂牛乳90 mL 378 1%美兰水溶液A4 6.5%氯化制肉汤肉浸液(pH7.6l氯化销A5 pH9.6葡萄糖肉汤GB/T 16347-1996 10 mL 100 mL 6 g 普通肉汤校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。A6 40%胆汁肉汤pH7.6肉浸液葡萄糖牛胆汁A7 淀粉水解培弊基60 mL 0.12 g 40 mL pH7.6肉浸液琼脂90 mL 羊血清5 mL 3%淀粉溶液10 mL A7.1 将肉浸液琼脂溶化。A7.2 待冷至50.C左右以无菌操作加入淀粉榕液及无菌羊血清混合后，倾注平板。A8 精氨酸水解培弊基蛋白陈氯化销磷酸氢二饵L精氨酸1.6%澳甲盼紫i酒精溶
12、液琼脂蒸馆水pH7.2 A9 事L醺杆菌糖发酵管A9.1 基础成分牛肉膏蛋白陈酵母浸膏吐温80琼脂1.6%澳甲盼紫酒精溶液蒸馆水o. 1 g 0.5 g 0.6 g 1 g 1.4 mL 0.3 g 100 mL 5 g 5g 5g 0.5 mL 1.5 g 1.4 mL 1000 mL A9.2 按0.5%加入所吉普糖类，并分装小试管。A10 七叶啻培弊基蛋白陈5g .1 79 GB!T 16347-1996 磷酸氢二仰1 g 七叶背3g 构橡酸铁0.5 g 1.6%澳甲雷击紫酒精溶液1. 4 mL 蒸馆水100 mL 附加说明g本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由南京市卫生防疫站、广东省食品卫生监督检验所、上海市食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人陈晓蔚、刘敏、杨明、宋曼丹、展明娟、周蓓君。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。380
