1、ICS 07.100.30 C 53 毒草3中华人民共和国国家标准G/T 19915.5-2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法Protocol of multiplex PCR identification of Stre ptococcus suis type 2 2005-09-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2005-11-01实施060609000417 中华人民共和国国家标准猪链球菌2型多重PCR栓测方法GB/T 19915. 5-2005 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668
2、517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数7千字2005年12月第一版2005年12月第一次印刷蜂书号I155066 1-26804定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533G/T 19915.5一2005前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人z韩雪清、林祥梅、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳、陈国强、张敬友、姜巍、唐泰山。本标准为首次发布。I GB/T
3、19915.5-2005 猪链球菌2型多重PCR检测方法1 范围本标准规定了猪链球菌2型多重PCR检测的操作方法。本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品(猪淋巴结、扁桃体、肉品等)中的猪源链球菌及猪链球菌2型。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义下列术语和定义适用于本标
4、准。3. 1 猪链球菌2型Stre ptococcus suis type 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为134及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。3.2 多重聚合酶链式反应(多重PCR)multiplex polymer副echain reaction 多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同-PCR反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片断的PCR反应。4 缩略语本标准采用下列缩略语:PCR 聚合酶链式反应DNA 脱氧核糖核酸dNTP
5、脱氧核酸三磷酸bp 碱基对5 试剂和材料除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T66821992的灭菌双蒸水或超纯水。5. 1 猪链球菌2型多重PCR反应混合物PCR缓冲液(含MgZ勺，2L;dNTP，1. 6L;引物1，0.6L;引物2，0.6L;引物3，0.6L;51物4，0.6L;菌液1.5L;酶0.2L;水12.3L;总体积20L。5.2 Taq DNA聚合酶5.3 10XPCR缓冲液100 mmol/L KCl , 160 mmol/L (NH4 )2S04 20 mmol/L MgS04, 200 mmol/L Tris-HCl GB/T 19915.5-2005 (
6、pH8.的，1% Triton X-100 , 1mg/ mL BSA。5.4 dNTP 混合液(各2.5mmol!L) 5.5 琼脂糖:电泳级5.6 澳化乙链5.7 DNA分子量标准5.8 TE缓冲液10 mmol!L Tris-HCl(pH8. 0) ,1 mmol!L EDTA。5.9 核酸电泳缓冲液Tris碱242g，冰乙酸57.1 稀释。6 仪器和设备6. 1 台式冷冻6.2 DNA热后6.3 核酸电击6.4 凝胶成6.5 可调移6.6 恒温水说7 操作方法7. 1 方法概要取培养菌液gPCR反应混合液中飞泳检测PCR产物，与结果。7.2 样晶采集在实验室生物安全柜中存于一200C备
7、用。7.3 组织样本DNA的制备L，加蒸馆水至1000 mL，使用时10倍和猪链球菌2型的采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书进行操作。7.4 多重PCR扩增将培养的细菌纯培养物样品(不经过离心)1. 2L、或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对照DNA各1.5L分别加入到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中缓冲液(含Mg2勺，2L;dNTP，1. 6L;引物1，0.6L;引物2，0.6L;引物3，0.6L;引物4，0.6L;酶0.2L;加水至总体积20L, 2 000 r/min离心10s，加入Taq酶(5U / /lL) O. 2L， 2 000 r/mi
8、n离心10 s，采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增。PCR扩增条件:940C7 min;940C 30 s , 60oC 30 s , 720C 1 min，40个循环;720C 10 mino扩增反应结2 GB/T 19915.5一2005束后，取出放置于40C。7.5 多重PCR扩增产物的电泳栓测称取2.0g琼脂糖加入100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加入适量的澳化乙键(0.5g/mU.然后制成凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝肢。取5L，.10L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9V/cm恒压下电泳30min 35 min.将电泳好的凝胶
9、放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。8 结果判定8. 1 试验结果成立条件猪链球菌2型阳性对照的PCR产物，经电泳后在305bp和460bp位置同时出现特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立。8.2 阳性判定在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在305bp和460bp的位置上同时出现特异性条带，判定为猪链球菌2型检测阳性F若305bp位置出现特异条带而460bp位置无特异条带，判定为猪源链球菌阳性，但不是2型菌。8.3 阴性判定如果在305bp和460bp的位置上均未出现特异性条带，判定为猪链球菌检测阴
10、性。山CON-m.巳FH阁。GB/T 19915.5-2005 附录A(规范性附景)幢测过程申防止交叉污染的措施样晶处理和DNA制备A.1 样品处理过程中，应防止不同样本之间的交叉污染，特别避免通过器具、手套、移液器等的污染。PCR检测过程A.2.1 实验前后，要把超净工作台的紫外灯打开，以破坏可能残留的DNA。A.2.2 抽样和制样工具必须清洁干净，且用于试验的器皿和离心管、PCR管等必须经过121.C、15min 高压灭菌后才可使用。A. 2. 3 PCR反应液配制、模板DNA提取、PCR扩增、电泳和结果观察等应分区或分室进行，实验室运作应从洁净区到、污染匹单方向进行。A.2.4 实验过程中，必须穿实验服，戴一次性手套，而且要及时更换。A.2.5 所有的试剂、器材、仪器都应专用，不得交叉使用。A.2 A丛究-必囚一权r一侵一祷仍一有四一专归一:z m号一价血书一定8.00元5-2005
