1、ICS 67. 1M. 3D C 53 道昌中华人民共不日国国家标准GB/T 22031-2008 干酷及加工干酶制品中添加的拧攥酸盐含量的测定酶-比色法Determination of added citrate content in cheese and processed cheese products-Enzyme-colorimetric method (lSO 12082: 1997 Processed cheese and processed chees巳productsCalculation of the co口tentof added citrate emulsifying
2、agents and acidifiers/pH-controlling agents, expressed as citric acid, MOD) 2008-06-17发布2008-10-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 22031-2008 前富本标准修改采用国际标准ISO12082，1997(加工干酷及其制品添加的拧橡酸盐乳化剂和酸度调节剂含量(以拧橡酸计的测定以英文版。考虑到我国国情，本标准与ISO12082: 1997的主要差异如下s一一分析步骤中增加标准曲线的绘制，由试液吸光度测定与标准系列比较定量，不采用国际标准中摩尔吸光系数计
3、算定量;乳糖含量的测定以试剂空白和试液空白扣除干扰组分和葡萄糖本底值，不采用国际标准中吸光度减量计算g免去国际标准中预试验和试验报告章条;编写格式、用语遵照我国标准GB/T1. 1-2000(标准化工作导则第l部分=标准的结构和编写规则和GB/T20001. 4-2001(标准编写规则第4部分z化学分析方法。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位=农业部食品质量监督检验测试中心(上海)。本标准主要起草人z孟瑾、韩奕奕、吴榕。I GB!T 22031-2008 1 范围干醋及加工干酷制品中添加的拧穰酸盐含量
4、的测定酶m比色法本标准规定了干酶及加工干酷制品中添加的拧橡酸盐含量(以拧橡酸计)的测定方法。本标准适用于干酶及加工干酶制品中添加的拧橡酸盐含量的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB!T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB!T6682-1992 , neq 150 3696 ,1987) 3 原理测定样品中总拧棱酸盐的含量，扣除原料带入样品中的
5、拧橡酸盐的量(以0.04倍乳糖换算)，即为样品中添加的拧棱酸盐含量。拧橡酸盐以拧棱酸计。4 分析步骤样品中总拧橡酸盐的测定和含量计算按附录A的规定执行。样品中乳糖的测定和含量计算按附录B的规定执行。5 结果计算样品中添加的拧棱酸盐含量叫以拧橡酸计，数值以质量分数(%)表示，按式(1)计算zWIl =wc叩-1飞Vi式中四c一一样品中总拧橡酸含量，%;一-原料辛L清粉或乳粉中拧稼酸含量与乳糖含量的比率(拧橡酸/乳糖)(r=O. 04); 叫一一一样品中乳糖含量，%。计算结果表示到小数点后两位。6 精密度.(1 ) 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10
6、%。1 GB/T 22031-2008 附录A(规范性附录)干酷及加工干酶串j品中拧橡酸盐含量的酶法测定A.1 范围本附录规定了酶法测定干酷及加本附录适用于干醋及加工A.2 原理酶(LDH)酸盐，分别转化成A.3 试剂A. 3.1 A.3.2 定容。定容至100mLo A.3.7 碳酸氢纳溶液(4.0瓶中，定容。充分混合。MDH)和乳酸脱氨以及脱竣产物丙酣nm处测定样品溶mL容量瓶中，定A.3.8 烟酿胶腺瞟岭二核背酸股股腺瞟岭二核背酸二纳盐(C21 H:nN7014P2Na2)和100mg碳酸氢销(Nat赞贸芳何帮帮于10mL水中。A.3.9 硫酸钱溶液(422g/L) :称取42.2g硫酸
7、镀(NH，)2S0，用水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。A.3.10 苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)悬浊液z用硫酸镀溶液(A.3. 9)分别溶解苹果酸脱氢酶(猪心，EC 1. 1. 1. 37)和乳酸脱氢酶(兔肉，EC 1. 1. 1. 27)，使苹果酸脱氢酶(MDH)的活性不低于600IU/mL、乳酸脱氢酶的活性不低于1400IU/mLo缓慢搅匀成悬浊液后，储存在ooC4 oC冰箱中，此溶液可以保存一年。A. 3.11 拧橡酸盐裂解酶(CL)溶液g用。水溶解拧橡酸盐裂解酶(产气肠杆菌，EC4. 1. 3.的，使拧棱酸盐裂解酶的活性不低于40IU/mLo缓慢搅匀成
8、悬浊液后，储存在ooC4 c冰箱中，此溶液可以保存一周;在一200C冰箱中，可以保存四周。2 GB/T 22031-2008 A. 3.12 拧橡酸标准溶液(160Ig/mL):称取175mg一水拧橡酸(C，H，O， H20)，用水溶解后转移至1000 mL容量瓶中，定容囚充分混合。A.4 仪器常用实验室仪器及以下各项。A. 4.1 分析天平z感量。.1mgo A.4.2 pH汁:精确至士0.1。A.4.3 粉碎机。A.4.4 具塞刻度比色管:10A.4.5 中速滤纸。A.4.6 紫外可A.4.7 水浴锅。A.5 试样审j备A. 5.1 A.6 A.6.1 称取1g 量瓶中，冷却纸(A.4.
9、5) A.6.2 测定A. 6. 2.1 标准曲试剂在使用前100 mL容30 mino用滤(A. 3. 3)调节滤液mL容量瓶中，用水两组拧橡酸标准溶液(A. 3. 12)，分别置于10浅L也驴铿靠在(A.4. 4中，各加入1.00 mL缓件液也3.6)、0.10mLNADH溶液也.3.8)、0.02mL苹果酸诋氢梅院副主和乳酸脱氢酶(lJil翁悬浊J(A.3. 10)，摇匀。在20oC 25 oC水浴锅(A.4. 7)中保持5、思，用水定容朝何铲霄汇。其中-JI拥1cm比色皿(A.4. 6)，以空气作参比，在波长340nm处测定各比笆替嘎率液的吸光度AO局在纽各力M、0.02mL的拧橡酸盐
10、裂解酶(A. 3. 11)，混匀，在20oC25 c水浴锅(A.4:r罚F雳辛苦10mi口，用1cm比色皿(A.4.的，以空气作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度AlOo根据式(A.1)计算吸光度A，以拧橡酸含量为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线口A二Ao-A10 ( A.1 ) 式中=Ao 拧橡酸盐裂解酶添加前的吸光度;A lO -拧棱酸盐裂解酶添加后水浴10min的吸光度。注z如果吸光度降低超过0.800，用水溶液稀释样品和空白试样，重复人6.2.1步骤。A.6.2.2 试液吸光度的测定用移液管吸取两份2.00mL试液(A.6.1)，置于10mL比色管(A.4. 4)
11、中。以下步骤闰A.6. 2.1 3 GB/T 22031-2008 中各加人1.00 mL缓冲液(A.3. 6)根据式(A.1)计算吸光度A操作，在标准曲线上查出对应的拧橡酸含量。同时做空白试验。A.7 结果计算样品中拧橡酸的含量X，以克每百克(g/100g)表示，按式(A.2)计算:x = _ _ _XV1 XV3 10 000 m X V2 X V, .(A. 2) 式中C一标准曲线上查出的试液中拧棱酸的含量，单位为微克(g); V1 试样经脱蛋白处理后的定容体积，100mL; V3 滤液定容体积，100mL; m 试样的质量，单位为克(g); V2 吸取滤液体积，25.00mL; V,
12、吸取试液体积，2.00mL。计算结果应扣除空白，保留三位有效数字。A.8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两次测定值的算术平均值的10%。4 附录B(规范性附录)干醋及加工干酶中乳糖含量的酶法测定B.1 范围本附录规定了酶法测定干酶及加工干酷fjIJ品中乳糖含量的方法。本附录适用于干酷及加工干酶制品中乳糖含景的酶法测定。B.2 原理GB/T 22031-2008 在半乳糖昔酶(卢GLS)催化下，乳糖被酶解为D葡萄糖(G)和b半乳糖(GL)。己糖激酶(HK)将D葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(G6P)，同时将三磷酸腺背(ATP)转化为二磷酸腺昔(ADP)。受6磷酸葡萄
13、糖脱氢酶(G6PDH)催化，6磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸(GA6的，同时烟酷胶腺嫖岭二核昔酸磷酸(NADP+)被还原成还原型烟酷胶腺瞟岭二核昔酸磷酸(NADPH)。在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。C12 H 0 1I (L)十凡OIEE，PGH1205(G)十D-C，HI20，(GL)HK D-C，HI20，(G)十ATP一G6P+ ADP _ G6PDH G6P + NADP+H20一一一一+GA6P十NADPH十日+B.3 试剂和材料所有的试剂如未注明规格，均为分析纯;实验用水如未注明，均应符合GB/T6682的规定aB. 3.1 乳糖标准
14、物质(C12H220lI H20)，纯度99%。B. 3. 2 亚铁氧化御溶液(36g/L) ，称取3.6日亚铁氧化饵凡Fe(CN)，J 3H20，用水溶解，定容至100 mL，混匀。B. 3. 3 硫酸钵溶液(72g/L) ，称取7.2g硫酸铮(ZnSO， 7日20)，用水溶解，定容至100mL，混匀。B. 3. 4 硫酸溶液(2mol/L)，用水稀释浓硫酸，浓硫酸2水为1 8(体积比)0 警告.稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断搅动。否则会引起爆炸。B.3.5 氢氧化纳溶液(200g/L)称取20.0g氢氧化销(NaOH)，用水溶解，定容至100mL，混匀。B. 3. 6 氢氧化纳
15、溶液(4g/L) ，称取4.0g氢氧化销(NaOH)，用水溶解，定容至1000 mL，混匀。B. 3. 7 硫酸钱溶液(422g/L) ，称取42.2g硫酸镀(NH，)2S0，J，用水溶解，定容至100mL，混匀。B. 3. 8 拧橡酸盐缓冲液(pH6.6)，分别称取2.8g拧稼酸销(C，H507Na， 2H20)、0.042g拧橡酸(C, H807 .日20)和0.635g七水硫酸筷(MgSO， 7H20)溶于40mL水中，用硫酸溶液也.3.4)或者氢氧化纳溶液也.3.6)调节pH至6.6士O.1后，用水定容至50mL.混匀后放置。C4 c冰箱中贮藏，可保存三个月，使用前放置至室温。B. 3
16、. 9 三乙醇胶(TEA)缓冲液(pH7.6)，分别称取14.0g盐酸三乙蹲胶(C，H15 NO, HCD和0.25g 七水硫酸续(MgSO， 7H2 0)，用80mL水溶解，用氮氧化纳溶液(B.3. 5)调节pH至7.6士O.1后，定容至100mL，混匀后放置。C4C冰箱中贮藏，可保存两个月回B. 3.10 NADP+-ATP-TEA缓冲悬浊液z分别准确称取65mg烟酿胶腺瞟岭二核昔酸磷酸二销(C21 H26N7 017 P，Na2)和170mg 5三磷酸腺昔二锅盐(C，OH14凡0P，Na2)，溶于30mL的三乙醇胶缓冲液(B.3. 9)中，混匀后放置。C4C冰箱中贮藏，可保持两周，使用前
17、放置至室温。B. 3. 11 半乳糖背酶-硫酸镀GLS-(NH，)2S0，J悬浊液(pH约7.6)，将半乳糖营酶(GLS，GB/T 22031-2008 埃希氏大肠杆菌，EC3.2. 1. 23)溶于硫酸钱溶液(B.3. 7)中，使乒半乳糖昔酶的活性不低于60IU/mL, 缓慢搅匀成悬浊液后放置。OC4c冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。B. 3.12 己糖激酶6磷酸葡萄糖脱氢酶-硫酸镀HK-G6PDH-(NH4)，S04J悬浊液E将己糖激酶(HK，酵母，EC2. 7. 1.1)和磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH，酵母，EC1.1. 1. 49)溶于硫酸镀溶液。.3.7)中
18、，使己糖激酶活性不低于280IU/mL(25 C) ，6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性不低于140IU/mL(25 C)。缓慢搅匀成悬浊液后放置。OC4C冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。B. 3.13 乳糖标准溶液C(CHOll H，O)=80g/mLJ，精确称取经87c烘烤2h至恒重的乳糖标准物质(B.3. 1)0. 842 g，溶于水中，定容至100mL，摇匀。准确吸取1.00 mL上述溶液，用水稀释到100 mL.即得浓度为80g/mL的乳糖标准工作溶液。该溶液放置。C4OC冰箱中，现用现配。B.4 仪器和设备实验室常规仪器及以下各项。B.4.1 分析天平z感量0.1m
19、g。B.4.2 定量滤纸z中速，直径15cm, B. 4. 3 比色管，10mL，带盖。B. 4. 4 分光光度计:340nm, l cm比色皿。B.4.5 水浴锅z能在20C36 C保温。B.5 试样制备取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。B.6 分析步骤B.6.1 试液的制备准确称取1g样品于烧杯中，用混水(40OC 50 C)溶解，玻璃棒搅拌，将烧杯中样品完全转移至100 mL容量瓶，用水定容，混匀。加入5mL亚铁氧化饵溶液(B.3. 2)、5mL硫酸绊溶液(B.3. 3)和10 mL氢氧化纳溶液(B.3. 6)，每次添加后充分混合溶液，用水定容至100mL，混
20、合均匀后静置30 min。过滤，弃去开始的部分滤液。吸取5.00mL滤液于100mL容量瓶中，用水定容至100mL，即为试液。B.6.2 标准曲线的绘制用微量移液管吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL乳糖标准工作溶液(B.3. 13)，分别置于比色管(B.4.3)中，各加入0.20mL拧橡酸盐缓冲溶液也.3.的、0.05mL 半乳糖背酶硫酸镀悬浊液(B. 3. 11)，摇匀，于水浴锅(B.4. 5)中恒温15min，取出后加入1.00 mL NADP+-ATP-TEA缓冲溶液(B. 3. 10)、0.05mL己糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶-硫酸镀悬浊液。.3.12)，
21、摇匀，于水浴锅(B.4. 5)中恒温60min，取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿(B.4.4)，以乳糖标准溶液含量为0的试剂溶液作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。B. 6. 3 试液眼光度的测定准确吸取1.00 mL试液(B.6.1)于比色管(B.4. 3)中，加人0.20mL拧棱酸盐缓冲溶液(B.3. 8)、1. 00 mL NADP+-ATP-TEA缓冲溶液(B.3. 10)、0.05mL己糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶-硫酸钱悬浊液(B.3. 12)，摇匀，于水浴锅(B.4.
22、 5)中恒温60min，取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min，作为试液参比溶液。准确吸取1.00 mL试液也.6.1)子比色管(B.4. 3)中。以下按B.6. 2各加入0.20mL拧稼酸盐缓冲溶液(B.3. 8).放置5min操作，用1cm比色皿(B.4.4)，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量囚B.7 结果计算试样中乳糖的含量X，以克每百克(g/100g)表示，按式(B.l)计算:x = _ _ _XV， XV, 10 000 m X Vz X V , 式中zc 标准曲线上查出的试液中乳糖的含量，单位为微克(g); V , 试样经脱蛋白处理后的定容体积，250mL; V , 滤液定容体积，100mL; m 试样的质量，单位为克(g);Vz一吸取滤液体积，5.00mL; V, 吸取试液体积，1.00 mL。用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。B.8 精密度GB/T 22031-2008 .( B.1 ) 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
