1、ICS 65. 120 B 46 中华人民共和国国家标准GB/T 23741-2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定Determination of four kinds of barbiturates in feeds 2009-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2009-09-01实施发布HU 1=1 本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本标准主要起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)。本标准主要起草人:李俊玲、李会荣、强莉、刘继明、门晓冬、李宏、杨志强。GB/T 23741-2
2、009 I GB/T 23741-2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定范围本标准规定了饲料中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相色谱-串联质谱测定法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定。高效液相色谱测定方法定量限为1mg/烛，液相色谱-串联质谱方法定量限为0.05mg/险。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版
3、本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008 , ISO 3696:1987 , MOD) GB/T 14699. 1饲料采样(GB/T14699.1-2005 ,ISO 6497:2002 ,IDT) GB/T 20195动物饲料试样的制备(GB/T20195-2006 , ISO 6498:1998 ,IDT) 3 方法原理试样中的4种巴比妥类药物用三氯甲:院提取、过滤，滤液吹干后溶解过固相萃取小柱净化，洗脱液蒸干后用甲醇水溶解，在高效液相色谱仪上分离、测定，或在高效液相色谱-串联质谱仪上测定，外标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，在分析中
4、仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合GB/T6682一级水的规定。4. 1 甲醇z色谱纯。4.2 乙睛:色谱纯。4.3 三氯甲:庭。4.4 二氯甲烧。4.5 2%甲醇水溶液z取2mL甲醇与98mL水混合。4.6 甲醇水溶液:1+1。4. 7 乙腊水溶液:30+7004.8 磷酸盐缓冲液:C(Na2HP04 +NaH2P04 2H20) =0.1 mmol/L , pH= 6.0。称取14.2g的元水磷酸氢二锅(Na2HP04)，加水定容至1000 mL，摇匀;另称取15.6g的磷酸二氢纳(NaH2P04 2H20) ，加水定容至1000mL，摇匀。取上述两种溶液按123+877的比例混匀即
5、可。4.9 流动相z甲醇+水=45+5504.10 巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品:纯度99.0%。4. 11 标准贮备液z准确称取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各25mg，分别用甲醇(4. 1)溶解，定容至25mL，配成浓度为1mg/mL的标准贮备液。2oC -8 oC冷藏保存，有效期三个月。4.12 混合标准中间液z准确移取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥贮备液(4.11)各5mL，用甲醇(4.1)定容至50mL，该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为100g/mLo 2 oC ,_,8 oC冷藏保存，有效期一个月。1 G/T
6、 23741-2009 4.13 固相萃取小柱z亲水亲脂平衡固相萃取柱，3mL(60 mg)。4.14 滤膜:0.22mo4.15 滤纸:快速，12.5cmo 5 仪器和设备5. 1 高效液相色谱仪z配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2 液相色谱-串联质谱仪z配电喷雾离子源。5.3 天平:感量为0.0001 go 5.4 氮吹仪。5.5 涡旋振荡器。5.6 国相萃取仪。6 试样制备按GB/T14699. 1采样。选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195规定，制备通过0.45 mm实验筛的试祥。7 试样处理7. 1 提取称取试料2g(精确至0.0001 g)于100mL离心管中
7、，准确加入25mL三氯甲:境(4.3)，涡旋振荡2 min，过滤。准确移取滤液15mL于具塞试管中，400C氮吹至干，加人磷酸盐缓冲液(4.8)3mL，涡旋溶解，备用。7.2 净化固相萃取小柱分别用5mL甲醇(4.1)、5mL水、5mL磷酸盐缓冲液(4.8)活化。取上述提取液(7.1)过柱，再分别用5mL磷酸盐缓冲液(4.的、5mL甲醇水溶液(4.5)淋洗，空气抽干30min，用10mL二氯甲烧(4.4)洗脱，收集洗脱液，400C氮吹至干，准确移取1mL甲蹲水溶液(4.6)溶解残渣，过0.22m滤膜后待测。8 液相色谱测定8. 1 液相色谱条件色谱柱:Cs柱长250mm，内径4.6mm，粒径5
8、m，或其他效果等同的Cs柱。柱温:室温。进样量:20Lo流动相:甲醇+水=45十550检测器:紫外检测器或二极管阵列检测器。检测波长:215nm。流速:1.0 mL/mino 8.2 标准曲线的绘制取混合标准中间液(4.12)适量逐步稀释，用甲醇(4.1)定容，配制成浓度分别为O.5g/mL、1.0g/mL、5.。g/mL、10.。g/mL、20.。g/mL、50.。g/mL的混合标准工作液，浓度由低到高进样，根据峰面积和浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.108.3 定量测定试料溶液(7.2)上机测定，用单点或多点校准法进行定量。多点校准法定量，根据峰面积的
9、响应值，从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(Cil);单点定量，根据样品峰面积的响应值与标准. GB/T 23741-2009 溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(Cil)。8.4 结果计算试料中4种巴比妥类药物的含量Xil，以质量分数计，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式(1)计算:式中zX-1-czlXV X V2Xl000 -1 m X V1 X 1 000 Cil一一试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一一加入提取液的总体积，单位为毫升(mL);V2一一一氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积
10、，单位为毫升(mL);m一一试料的质量，单位为克(g); V1一一移取滤液的体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。8.5 重复性( 1 ) 在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。9 液相色谱串联质谱法(仲裁法)9. 1 液相色谱条件色谱柱:C18柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7m，或其他效果等同的C18柱;柱温:40oC; 进样量:5L;流动相:乙腊十水，梯度洗脱，见表1;表1液相色谱串联质谱流动相梯度洗脱表时间/min水/%乙腊/%0.0 0.5 1. 0 4.0 4.01 10.0 流速:
11、0.4mL/min。9.2 质谱条件离子源:电喷雾离子源;扫描方式=负离子扫描;检测方式z多反应监测(MRM);毛细管电压:4.0kV; 干燥气温度:350oC; 干燥气流速:10 L/min; 雾化气压力:o. 241 MPa(35 psi) ; 70 70 50 20 70 70 定性离子、定量离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2。30 30 50 80 30 30 3 GB/T 23741-2009 表24种巴比妥类药物的定性、定量离子对及碰撞能量被测物名称定性离子对定量离子对保留时间/(m/z) (m/z) 183.284.9 巴比妥183.2140.1 183.21
12、40.1 23 1. 084. 9 苯巴比妥23 1. 0 188. 1 23 1. 0 188. 1 225.284.9 异戊巴比妥225.2182.2 225.2182.2 237.284.9 司可巴比妥237.2194.2 237.2194.2 9.3 巴比妥类药物定性、定量离子对及碰撞能量4种巴比妥类药物定性、定量离子对及碰撞能量见表209.4 标准曲线的绘制mm 0.933 1. 615 3.179 3. 750 毛细管出口端电压/V 80 80 80 80 碰撞能量/eV 20 5 10 5 10 10 20 5 取混合标准中间液(4.12)适量逐步稀释，用乙腊水(4.7)稀释定容
13、，配制成浓度分别为0.01g/mL、0.025g/mL、0.050g/mL、0.075g/mL、0.100g/mL、0.200g/mL的混合标准工作液，浓度由低到高进样，根据峰面积和浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱条件下标准样品图谱参见图A.2。9.5 试液准备取7.2项下的待测液，根据药物的浓度用乙腊水溶液(4.7)适当稀释。9.6 定性测定根据试样中各种化合物的保留时间和特征选择离子定性，试样中待测物质的保留时间与混合标准品工作液中对应的保留时间偏差在:1:2.5%之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准品工作液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比
14、较，若相差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大相差% 相对离子丰度50 2050 10-20 10 允许的最大相差I :1: 15 I 士20I 士25I 士309. 7 定量测定以定量离子的色谱峰面积进行单点或多点校正定量。多点校准法定量，根据峰面积的响应值，从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(Ci2);单点定量，根据样品峰面积的响应值与标准溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(Ci2)。9.8 结果计算试料中4种巴比妥类药物的含量Xi2，以质量分数计，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式
15、(2)计算z4 式中zX,? = Ci2 X V _ V2 _ V4 ? 182. 199 22) J1 1 1 I 1_lkl 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J 1 I I ;JI1 1 1.1 1 1 1 .1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 81 寸JII 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1斗1一一-总离子流色谱图;2一一司可巴比妥定性离子53一一司可巴比妥定量离子54一一苯巴比妥定性离子z5一一一苯巴比妥定量离子;6一一异戊巴比妥定性离子;7一异戊巴比妥定量离子;8巴比妥定性离子;9一一一巴比妥定量离子。_30.616 30 mm 图A.2
16、4种巴比妥类药物液相色谱串联质谱图(MRM色谱图)(200 ng/mL) 6 gONlF寸队的NH筒。华人民共和国家标准饲料中4种巴比妥类药物的测定GB/T 23741 2009 国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销苦印张O.75 字数12千字2009年7月第一次印刷开本880X12301/16 2009年7月第一版祷定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-38178 GB/T 23741一2009打印日期:2009年10月14日
