1、ICS 65. 120 B 46 中华人民主t./、不日国国家标准GB/T 23743-2009 饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的微生物学检验Baird-Parker 琼脂培养基计数法Microbiological examination of the enumeration of coagulase-positive staphylococci in feeds-Technique using Baird-Parker agar medium (ISO 6888-1: 1999/ AMD. 1: 2003 , Microbiology of food and animal feeding stuf
2、fs-Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)一一Part 1: Technique using Baird -Parker agar medium; Amendment 1: Inclusion of precision data, MOD) 2009-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2009-09-01实施发布中华人民共和国国家标准饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的微
3、生物学检验Baird-Parker 琼脂培养基计数法GB/T 23743-2009 骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数18千字2009年7月第一版2009年7月第一次印刷祷书号:155066 1-38180 定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 23743-2009 目。吕本标准修改采用ISO6888-1: 1999/ AMD. 1: 200
4、3(英文版)。本标准根据ISO6888-1: 1999/ AMD. 1: 2003重新起草。除删除了前言和参考文献外，本标准的顺序编号与ISO6888-1: 1999/ AMD. 1: 2003完全一样。ISO 6888的三个部分是平行的三个方法，本标准只规定了Baird-Parker琼脂培养基法。考虑到本标准的适用范围和我国对标准编写的具体要求，在采用ISO6888-1: 1999/ AMD. 1 :2003 时，本标准作了一些编辑性修改。由于ISO6888-1: 1999/AMD. 1:2003的范围是食品和饲料，本标准删除了仅涉及食品的部分内容。有关技术性差异已编入正文中并在它们所涉及的
5、条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录A中给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。为了便于使用，对于ISO6888-1: 1999/ AMD. 1 :2003还作了下列编辑性修改:a) 本国际标准一词改为本标准气b) 稀释液和培养基中的表格改为文字描述;c) 用小数点代替作为小数点的，;d) 正文中的公式增加序号。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本标准起草单位z中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京门。本标准主要起草人:饶正华、李丽蓓、马东霞、张苏、苏晓鸥。I 范围饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的
6、微生物学检验Baird-Parker 琼脂培养基计数法G/T 23743-2009 本标准规定了凝固酶阳性葡萄球菌在固体培养基CBaird-Parker培养基)上、36oc士1oc好氧条件|下培养后进行菌落计数的技术要求。I本标准适用于饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。-凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.1 食品卫生微生物学检验总则GB/T
7、14699. 1饲料采样CGB/T 14699. 1-2005 , IS0 6497: 2002 , lDT) GB/T 20195动物饲料试样的制备CGB/T20195-2006 ,IS0 6498:1998 , IDT) IS0 5725-2 测试方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测试方法重复性和可再现性的基本方法IS0 16140 食品和动物饲料微生物学替代方法确认草案3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 凝固酶阳性葡萄球菌coagulase -positive staphylococci 在本标准规定的检验条件下，在选择性固体培养基中培养可形成典型或/
8、和非典型菌落且血浆凝固腾试验为阳性的一群细菌。3.2 凝固酶阳性葡萄球菌的计数enumeration of coagulase-positive staphylococci 按本标准规定的方法，每毫升或每克试样中凝固酶阳性葡萄球菌的数量。4 原理4. 1 用表面接种法在固体选择性培养基上进行定量接种，同时接种两个平皿。液体样品直接接种，其他样品需用1: 10稀释液接种。在其他稀释度，同上法用稀释液接种。每个稀释度接种两个平皿。4.2 培养皿在36oC :f: 1 oC好氧培养，在培养24h和48h时均要进行检查。I4.3 选择合适的稀释度水平，数平皿中生长的菌落数，计算每克(每毫升)样品中含有
9、凝固酶阳性葡萄.球茵的数量。5 稀释液和培养基5. 1且有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馆水或去离子水或相叫GB/T 23743-2009 度的水。5.2 稀释液生理盐水:氯化纳8. 5 g 水1000 mL 溶解后，分装到加有玻璃珠的锥形瓶内，每瓶225mL, 121 oc灭菌15mino 5.3 Baird-Parker琼脂培养基注:可以使用商品培养基。使用时，严格按照使用说明操作。5.3.1 基础培养基5.3. 1. 1 成分膜蛋白陈酵母膏肉膏丙酣酸纳L-甘氨酸氯化铿琼脂水10.0 g 1. 0g 5.0 g 10.0 g 12.0 g 5.0 g L m nv
10、 nu nu g-n为积gbLa-M终5.3. 1. 2 制备将上述成分煮沸溶解，商品基础培养基则按使用说明配制。必要时校正pH，使培养基灭菌后在25 c下pH为7.2士0.2。然后分装100mL到三角瓶或其他合适的容器中。121oc灭菌15mino 5.3.2 溶液5.3.2.1 亚甜酸饵溶液5.3.2. 1. 1 成分亚硝酸饵2(K2 Te03) 水1. 0g 100 mL 5.3.2. 1. 2 制备稍微加热，使亚暗酸铮在水中完全溶解。亚暗酸饵应当是易溶的，如果在水中有白色不溶物，此试剂不可再用。用0.22m的滤膜过滤除菌。此溶液在3oc士2oc最多可保存一个月。溶液中形成白色沉淀时，应
11、弃之不用。5.3.2.2 卵黄乳液浓度约为20%或遵照厂家规定。注:可使用商品培养基。取外壳完好的新鲜鸡蛋，用刷子蘸液体清洁剂刷洗蛋壳，再在流水中冲洗。然后将它们浸入70%酒精30s消毒后风干或用酒精喷洒之上，采用火焰灭菌。在无菌条件下，打破鸡蛋，不断吸出卵黄，从而把蛋白和卵黄分开。将卵黄放人灭菌三角瓶中，加人四倍体积的水，充分搅匀。47oC水浴中加热2h，然后置于3oC士2oC下保持18h ,._, 24 h以形成沉淀。元菌操作，将上清液转入另一灭菌三角瓶中。1 琼脂的添加量取决于凝肢的强度。2 建议在使用之前，检查用于本试验的亚蹄酸御的有效性(见5.3.2.1.2)。2 G/T 23743
12、-2009 此液在3oc士2oc最多可保存72ho 5.3.2.3 磺肢二甲晤睫溶液注:此溶液仅在试样中怀疑有变形杆菌时用。5.3.2.3. 1 成分磺胶二甲略皖0.2 g 氢氧化销溶液，c(NaOH)=0.1 mol/L 10 mL 水90mL 5.3.2.3.2 制备将磺胶二甲略院溶解于氢氧化销(NaOH)溶液中。用水稀释到100mL，用O.22m的滤膜过滤除菌。此溶液在3oc士2oc最多可保存一个月。5.3.3 完全培养基5.3.3.1 成分基础培养基(5.3.。亚暗酸饵溶液(5.3. 2. 1) 卵黄乳液(5.3. 2. 2) 磺胶二甲暗睫(5.3. 2. 3) (必要时加入5.3.3
13、.2 制备熔化基础培养基，然后在水浴中凉至约470C。100 mL 1. 0 mL 5.0 mL 2.5 mL 将亚暗酸饵和磺胶二甲略脆溶液试样中怀疑有变形杆菌时加入水浴加热至470C左右，无菌操作加入到基础培养基中，混合均匀。5.3.4 琼脂平板制备将合适量的完全培养基倒入平皿中，使平皿内琼脂厚度约为4mm，然后让其凝固。这些平板干燥之前，可在3oC士2oC保存24h。注:使用商品培养基制备平板时，应注意厂家说明书中的保质期。使用平板前，应在25oC ., 50 oC的干燥箱中倒置干燥，直到培养基表面没有小滴水珠出现为止。5.4 脑心浸液肉汤5.4.1 成分动物组织消化汤脱水牛脑浸液脱水牛心
14、浸液葡萄糖氯化销磷酸氢二锅(Na2HP04)水5.4.2 制备将完全培养基溶于水中，必要时加热。10.0 g 12.5 g 5.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1 000 mL 校正pH值，使培养基灭菌后在25oC时pH为7.4士0.20将培养基定量转移5mL., 10 mL到试管或合适容量的瓶中。121 oC灭菌15millo 5.5 兔血浆使用商家脱水兔血浆并根据商品说明进行重新水化。若没有脱水血浆，可用三倍体积的灭菌水对一倍体积的新鲜灭菌兔血浆进行稀释。3 GB/T 23743-2009 若拧橡酸饵或拧棱酸纳被用作血浆抗凝血剂，加0.1%EDTA到重新水化或稀释的血浆中。若无
15、厂家规定，经重新水化和稀释的血浆应立即使用。使用前，分别用凝固酶阳性和阴性葡萄球菌对血浆进行验证。6 仪器与玻璃器皿注:如果有相配的规格，可用一次性仪器代替可重复使用的玻璃仪器。常规微生物室用仪器，见GB/T4789.1。其他如下:6. 1 干热及湿热灭菌器。6.2 培养箱:36oc士1oc。6.3 干燥箱:温度范围为25oc士1oc到50oc士1oc之间。6.4 水浴锅:470C士2oC。6.5 试管、三角瓶和带螺帽的瓶子。6.6 灭菌平皿z直径为90mm或140mm。6.7 接种针和移液管。6.8 刻度管z容积分别为1mL、2mL和10mL，最小分刻度分别为0.1mL、0.1mL和0.1m
16、L。6.9 刮铲:需灭菌，由玻璃或塑料制成。6.10 pH计z要求此pH仪在25oC最小检测单位为0.010测定时pH精确到土0.1个单位。7 采样实验室样品真实、具有代表性、在运输和贮存过程中没有发生损失或改变是非常重要的。在采样过程中，采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品包装为袋、瓶和罐装者，就取完整的未开封的。样品是固体粉末，应边取边混和;是流体的，通过振摇即可混匀。样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将试样于ooC ,_, 5 oC中保存(如冰壶。采样数量和方式按GB/T14699. 1执行。8 试样的制备按照GB/T
17、20195的规定制备试样(制备工具应是灭菌的)，在密闭瓶中低温保存。9 操作步骤9. 1 1: 10稀释液和更高稀释液的制备以无菌操作将经过充分混匀的试样25g(或25mL)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌瓶内配成10-1稀释液。若需配制10-2可取10-1稀释液1mL加入到9mL元菌生理盐水试管中，更高稀释度可按此方法操作。9.2 接种9.2.1 用灭菌移液管将0.1mL试样原液液态样)或10-1稀释液(固态样)分别转人两个琼脂平板中。必要时做10-2或做更高适宜稀释度。9.2.2 对含凝固酶阳性葡萄球菌量较少的样品，可增加接种量至1.0 mL。接种方式用表面接种，涂在一个大的平皿(14
18、0mm)或三个小的平皿(90mm)上，三个小的平皿的接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4 mL。9.2.3 用刮铲在琼脂平板表面接种时，应仔细而迅速，尽量不要接触平皿边缘。盖上盖，在室温下保持15 mn，使平板干燥。9.3 培养将9.2.3中接种的平板置于360C士1oC培养箱中培养24h:f: 2 h，观察后，继续培养24h士2h。4 GB/T 23743-2009 9.4 平板的选择与解释9.4.1 培养24h士2h后，在平板底部标上典型菌落的位置。将所有的平板在36oc士1oc继续培养|24 h士2h，标记新出现的典型菌落。同时也标记所有不典型的菌落。I仅仅挑选同一稀释度中、两个平
19、行中菌落数在最多300个(含有150个典型或不典型菌落)最少15个的平板用来计数。若一个平板中只有典型(或不典型)菌落时，通常挑选5个典型或不典型)菌落做鉴定;若平板中既有典型又有不典型菌落时，应各选5个做鉴定。如果液态样原液或固态样10-1稀释度的平板上菌落数小于15个，按9.4.3和10.2对菌落数进行计算。注1:典型菌落呈黑色或灰色，光滑，凸起，菌落直径在培养24h后为1mm1. 5 mm，培养48h后为1.5 mm 2.5 mm，菌落周围为一透明带，也可能部分是不透明的。在培养至少24h后，透明带可能会表现为乳白色的圈。注2:非典型菌落与典型菌落大小相当，可能会表现出如下形态之一一光滑
20、，黑色，具有或不具有狭窄的白色边缘，透明带不显现或者刚刚可见，乳白色的圈不显现或者很难观察;一一没有透明带的灰色菌落。非典型菌落主要由来自牛奶、虾、杂碎制品中污染的凝固酶阳性葡萄球菌产生，其他制品的污染则比较少见。注3:平板上生长的其他菌落可能并未表现出注1和注2中所描述的典型或非典型的形态，可把它们当作背景菌群。9.4.2 如果接种量为1.0 mL(9. 2. 2) ，涂在三个平板上(9.2.2)，把这些平板当作一个进行随后的计数和鉴定。:LL若凝固酶阳性菌数小于叫进行估计时，应保留所有典型和非典型菌落挑取所有的菌落进|9.5 确证(凝固酶试验)将挑取的菌落用灭菌接种针接种至脑心浸液肉汤中，
21、在36oc士1oc培养24h士2h。元菌操作，将每个培养液接种0.1mL至含0.3mL(除非厂家规定用其他量)兔血浆的灭菌溶血管中，36oc士1oc培养24h士2h。培养4h-6h后，倾斜试管，检查血浆是否凝结。如果没有凝结，应培养24h或按厂家规定的时间进行检查。若凝块体积超过原液体积的一半，则可认为凝固酶试验阳性。阴性对照z加0.1mL灭菌脑心浸液肉汤到一定量兔血浆中，不接种，培养。对照血浆应呈现出元凝块。注:本标准测定的是凝固酶阳性葡萄球菌，但必须认识到，有些金黄色葡萄球菌的菌株凝固酶阳性反应较弱而很难区分，需要补充进行本标准中未包括的试验，如溶葡菌酶灵敏性试验、产溶血素试验、核酸酶热稳
22、定性试验和甘露醇产酸试验。10 结果表示10. 1 总则10. 1. 1 每个平板中凝固酶阳性葡萄球菌的数量的计算见式(1):式中z:主二Xc +旦旦XcAc .c I Anc a一一每个平板中凝固酶阳性葡萄球菌的数量，个;bc .凝固酶试验阳性的典型菌落数，个5Ac -.用来做凝固酶试验的典型菌落数，个;. ( 1 ) 5 G/T 23743-2009 Cc二平板中典型菌落总数，个;bnc一一凝固酶试验阳性的不典型菌落数，个;Anc一用来做凝固酶试验的不典型菌落数，个pCnc一一平板中不典型菌落总数，个。10. 1. 2 试样中凝固酶阳性葡萄球菌的含量N的计算见式(2): N = _ a -
23、Vx (n1十O.1n2) X d 式中zN-试样中凝固酶阳性葡萄球菌的含量，CFU/g;a一一-所有挑选平板中含有的凝固酶阳性葡萄球菌菌落总数，个;V一一每个平皿的接种量，mL;n1一一在挑选的平板第一个稀释度的平皿数，个;叫一一在挑选的平板第二个稀释度的平皿数，个pd一一挑选的第一个稀释度。. ( 2 ) 计算每克每毫升样品中含凝固酶阳性葡萄球菌的数量，按科学计数法报告结果，保留两位有效数字。示例:如接种量为0.1mL，第一个被选择的稀释度为10斗，两个平行中含典型菌落数分别为65、85，没有不典型菌落;第二个被选择的稀释度为10-3，两个平行中含典型菌落数分别为3、7，没有不典型菌落。其
24、中65个菌落中有5个菌落被鉴定且均为凝固酶阳性，即a=65;85个菌落中有5个菌落被鉴定且3个为凝固酶阳性，即=51;3个菌落中有3个菌落被鉴定且均为凝固酶阳性.HPa=3;7个菌落中有5个菌落被鉴定且均为凝固酶阳性，即=70则N=;二;二;工Z=57272报告结果即为:5.7X 1040 10.2 低菌数量的计算方法10.2. 1 若液体样品或固体样品的10-1稀释度的两个平皿中，含有鉴定的菌落数小于15，报告如下:a) 液态样式中zNe = _a 一二VX2 Ne一一一每毫升试样含凝固酶阳性葡萄球菌的数量，CFU/mL;a一一两个被选择平板中确定为凝固酶阳性葡萄球菌的总数，个;V一一每个平
25、板的接种量，mLob) 国态样式中zNe = _ a VX2Xd Ne一一每克试样含凝固酶阳性葡萄球菌的数量，CFU/g;L;a一一两个被选择平板中确定为凝固酶阳性葡萄球菌的总数，个;V一每个平板的接种量，mL;d一一一稀释度，10一1。. ( 3 ) ( 4 ) 10.2.2 若试祥(液态样)或10-1稀释液固态样)的两个平皿元任何凝固酶阳性葡萄球菌生长且接种量为0.1mL，结果报告如下:a) 液态样:每毫升含凝固酶阳性葡萄球菌小于10CFU; 6 GB/T 23743-2009 b) 固态样:每克含凝固酶阳性葡萄球菌小于10/dCFU，式中d为稀释度10-10若液态样或固态样的10-1稀释
26、度的两个平皿均无凝固酶阳性葡萄球菌生长且接种量为1mL，结果报告如下:a) 液态样:每毫升含凝固酶阳性葡萄球菌小于10CFU; b) 固态样:每克含凝固酶阳性葡萄球菌小于10/dCFU，式中d为稀释度10-1。11 精密度11. 1 总则定量方法的精密度可如ISO5725-2中规定的一样，用重复性和再现性来表示。但是，ISO5725-2 是基于平均值的计算方法，并不总是适合于微生物检测，因为微生物并不总是表现出正态分布。因而，在ISO16140中，专门制定了适合于微生物的对重复性和再现性的计算方法。这种统计法的优点在于对极值更不灵敏，因而可以保留对偏离值的统计。统计者可以使用本章的内容。11.
27、 2 重复性11. 2. 1 重复性限同一个操作者使用同一仪器，对相同的试验基质用同一种方法在尽可能短的间隔时间里重复做出的两个单独的测试结果(每克或每毫升中凝固酶阳性葡萄球菌数量的对数值)，绝对相差或者在正常范围内的两个结果中高值与低值的比值，应当不超过重复性限(纱的5%。11. 2. 2 总体值通常情况下，检测饲料样品时，是用下面的重复性限(纱，r值通常适用于所有的基质zr=0.28(表示检验结果对数值的绝对相差); r=1. 9(表示在正常范围内的两个检验结果中高值与低值的比值)。示例:观察到饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的第一个检测结果为10000CFU/g或1.0 X 104 CFU/g，
28、按重复性要求，高值与低值的比例不超过1.9，因此，第二个结果应在5263 (= 10 000/1. 9) CFU/g- 19 000 (= 10 000 X 1. 9) CFU/g 之间。11. 3 再现性11. 3. 1 再现性限不同的操作者在不同的实验室用不同的仪器，对相同的试验基质用同一种方法做出的两个单独的测试结果(每克或每毫升中凝固酶阳性葡萄球菌数量的对数值)，绝对相差或者在正常范围内的两个结果中高值与低值的比值，应当不超过再现性限(R)的5%。11. 3. 2 总体值通常情况下，检测饲料样品时，是用下面的再现性限(R)，R值通常适用于所有的基质zR=0.43(表示检验结果对数值的绝
29、对相差);I R=2.7(表示在正常范围内的两个检验结果中高值与低值的比值)0 I 示例1:第一个实验室得到饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测结果为1.ox 104CFU/g，按再现性要求，第一个检测结果与第二个实验室结果的比值不超过2.7，因此，第二个实验室凝固酶阳性葡萄球菌的检测值应在3.7 X 103 (= 1. 0 X 104/2. 7) CFU/g-2. 7 X 104 (= 1. 0 X 104 X 2. 7)CFU/g之间。示例2:实验室想知道符合预设限(如105或以10为底对数为5)的最大水平，应用R值(取对数)XO. 59。结果的对数差是0.25(=0.43XO. 59)，结果比
30、值在100.25.因此，结果高于loglo5.25 (= loglo 5 + loglO 0.25)或1.8 X 105并不表明不符合此限。0.59这个因子反映在单边95%置信度下检测是否超出了再现性限。0.59因子由下面的公式获得z1. 96 x .;z 12 检验报告检验报告应包括完整的样品鉴定所需的全部详细内容。检验报告应包括采样方法、检验方法和检验结果，它应阐明在标准中规定的条件或可供选择的条件，以及所有可能影响结果的细节。goN|仍泛的NH筒。GB/T 23743-2009 附录(资料性附录)本标准与IS06888-1 : 1999/ AMD. 1 : 2003的技术性差异及其原因A
31、 表A.1给出了本标准与ISO6888-1: 1999/ AMD. 1: 2003的技术性差异及原因的一览表。表A.1本标准与IS06888-1: 1999/AMD. 1 :2003技术性差异及原因本标准的章条编号技术性差异原因1 删除ISO6888-1标准范围中适用于人类消费品。本标准范围只针对饲料。2 5.1 5.2 用GB/T4789.1、GB/T14699. 1和GB/T20195和为了与我国的标准相一致，并方便标准6 文字描述替换ISO6887-1和ISO7218。使用者查询。7 8 9.1 4.2 9.3 将温度定为360C土1oC，同时删除脚注。进行统一，便于实验人员操作。9.4
32、.1 9.5.1 9.1 增加了更高稀释度的配制方法。便于实验人员操作。9.2.2 增加了对三个小的平皿上接种量的规定。便于实验人员操作。9.4.3 增加了对低菌数的数量规定。便于实验人员操作。9.5 增加注。原国际标准前言中的内容，比较重要。11. 2.2 删去对胶囊食品的特殊规定。饲料通常没有胶囊状的。11. 3. 2 删除ISO6888-1标准中的附录A。按规定增加我ISO 6888-1附录A中实验室间试验结附录A果针对干醋、肉、蛋粉等食品类，与饲料国标准的附录Ao无关。侵权必究版权专有* 书号:155066 1-38180 16.00元定价=GB/T 23743-2009 打印日期:2009年10月14日
