1、ICS 67.050 X 04 GB 国家标准国不日+l: 、中华人民G/T 23814-2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detecting kidney beans components in lotus foods 2009-05-27发布2009-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 23814-2009 士一同目。本标准的附录A为资料性附录。本标准由中国标准化研究院提出并归口.本标准负责起草单位z国家加工食品质量监督检验中心(广州
2、、广州市质量监督检测研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人z蔡依军、罩芳芳、罗海英、那鸿铃、郭新东、吴玉盔、蓝芳。I ,( 生GB/T 23814-2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法1 范围本标准规定了莲蓉制品中芸豆成分的定性PCR检测方法.本标准适用于由莲蓉制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测。本标准的检出限为0.5ng芸豆DNA。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注
3、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008, ISO 3696: 1987 , MOD) GB/T 19495. 1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495. 2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495. 7 转基因产品检测抽样和制样方法3 术语和定义GB/T 19495. 1确立的术语和定义适用于本标准。4 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。5 抽样和制样按照GB/T19495. 7规定的方法执行。6 测定方法6. 1 原理样品经DNA提取后，针对芸豆特异
4、基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增芸豆基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有芸豆成分。6.2 试剂和材料除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。6.2. 1 引物:检测莲蓉制品内源基因和芸豆特异基因的引物及其信息见表1。襄1莲蕃制晶肉、外源基因所需的引物信息检测基因引物序列PCR产物大小/基因性质适用范围bp 正，5-GT AGAATCGGCACTGGAGGT AG-3 莲子特异基因莲蓉制品NNEA0732 142 反，5-CATGGGCT AACCAACT AGACAGC-3 正，5-CAGACATTTCAT ATCCAG
5、GGAGG-3 芸豆特异基因AB070627 194 莲蓉制品反，5-TGAATTGTACGGTGAAGGATGG-3GB/ T 238 14-2009 6.2.2 琼脂黯:电泳纯。6.2. 3 Tris饱和酣36.2.4三1甲:皖6.2.5 冰乙自主.6.2.6 无水乙醇.6.2.7 异I且应.6.2. 8 并阿醉6. 2.9 氢氧化铀(NaOH) 6.2. 10 位酸(HCI).6.2. 11 三经甲基氨基甲烧(Tri:Wo6. 2. 12 乙二股VYL.酸锅盐afEDTI6.2.13 前糖.6.2.14 6.2.15 6.2.16 6.2.17 6.2. 18 6. 2. 19 Na，E
6、DTA.用H6.2.20 TE缓6.2.21 6.2. 22 6.2.23 6.2.24 6.2.25 6.2.26 DNA分6.3 主要仪器6.3.1 PCR热循环、6.3. 2 电泳仪。6.3.3 凝胶成像系统s O. 01 mI/L.Na l!DT aq酶.dNTPlO XBuffer，氯化接(Mg.25%漠酷蓝.40:1币(6.3. 4 离心机:12 000 r / ml 6.3.5 涡旋振荡器。6.3.6 分析天平:0.1 g。6. 3. 7 微量可调移液器:0.5L，2L，lO1汀，而悔，也.1伸恒汇，200L，lLJ6.3.8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4 检测步骤6.
7、4. 1 模板DNA的提取6. 4. 1. 1 对照设置阳性对照:莲子基因组DNA、芸豆基因组DNA;阴性对照:已知以不合该基凶的佯品捉取的DNA;空白对照:双羔水(ddHO) 6. 4. 1. 2 DNA提取步骤11) $(:,./, DNA提取时设权平行;2 / mL O. 5 mol!L pH至8.0。G/ T 23H14- 2009 b 将样品粉碎，取适量样品，加入4LTE是冲破(1!.2.20)，将沉捷克全溶解jc ) 加入与溶液等体积革酣+三氯甲烧+异戊蹲(25十21十1)(6.2.16)，重复强匀lmm;d ) 12000 r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1
8、.5 mL离心管中;e) JJII入与上清液等体积三氯甲烧+异戊醉(24斗1)(6.2.17)，重复混匀10min; f) 12000 r/min室温离心10min，小心吸取上清液;g) Jm入上请液1/10体积3mollL乙酸饷(6.2.18)，)lU入2倍-2.5倍体积经山顿冷的亢水乙醇(6.2.6)，颠倒混匀后一20.C静宣1h;或加入等体积异丙醇(6.2.8)，海匀后室温静置检测样品内性对照、阴性对照幅画圃，、表2-、Y的试剂名称10 x PCR Buffer MgCI, dNTP Primers 20 pmol!L Tlq 5 U/ J.lL TI!Tnplate O. 1g/.-0
9、.2g/L ddH20 6.4.3.2 PCR反应循环参蚊见表3.10 min h) 15 000 r min.室混离心1飞nin，弃去上清液;) 70%乙醇(6.2.21)赏集沉淀2比j) 50L O. 1 X TE. 2O潢懈沉淀，1.C保存。也可以用等效DN.结枣树l盒(6.2.25)提取样品DA，按蜻l盒操 260 nm和2802费量的两定用幢幢蛋白哺析仪或紫外分飞比光度TE缀忡擅(6.2.20)进相稀.，用棋院量由分析吸光值1011鞠A.，(;，omL饱眼度篝式。冉算:c A X N x 500/ 1 000 式中:A- - 260 N一一核L 2. 5 2. 5 2.0 正:0.2
10、5反:0.25O. 15 补足反应体系总体积为253 GB/T 23814一2009表3各基因检测PCR反应条件基因变性扩增循环数后延伸94 C /30 s 莲子特异基因94 C /5 min 58 C /30 s 35 72 C/ 5 min 72 C /30 s 94 C /30 s 芸豆内源基因94 C/5 min 56 C /30 s 35 72 C/5 min 72 C /30 s 6.4.4 PCR扩增产物电泳检测将适量的琼脂糖(6.2.2)加入1XTAE缓冲液(6.2.19)中，配制成浓度为2%(质量浓度)的溶液，加热溶解，然后加入澳化乙键溶液(6.2.23)至终浓度0.5g/m
11、L，混匀，稍适冷却后，倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固后，放入盛1XTAE缓冲液的电泳槽中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10L-20LPCR产物与上样缓冲液2L混合)，其中一个泳道中加入DNA分子质量标准品(6.2.26)5L，接通电源电泳，按2V/cm的电压电泳至澳酣蓝迁移至3cm-5 cm处结束。凝胶成像仪观察并分析记录。6.4.5 结果分析6.4.5. 1 蓬蕃内源基国的检测用针对莲蓉内源基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR扩增，阳性对照和待测样品均应被扩增出142怜的PCR产物，阴性对照和空白对照应不能扩增得到相应
12、的PCR产物。如待测样品未见有该PCR扩增产物，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物。6.4.5.2 芸豆基因的栓测对样品DNA进行芸豆内源基因的PCR扩增，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小194b肘，则可初步判定待测样品中含有可疑的芸豆成分，应进一步进行确证实验，依据确证实验的结果最终报告d日果待测样品未出现PCR扩增产物，则可断定待测样品中不含有芸豆成分。6.4.6 确证实验当PCR检测结果为阳性时，可通过酶切的方法或其他方法(如测序比对，序列参见附录A
13、)进行确证zPCR产物的限制性内!;JJ酶酶切分析E用内切酶ApaI对PCR扩增产物进行酶切分析，阳性样品酶切片段大小为81bp和103bp。推荐酶切体系为50L，PCR扩增产物20L，酶用量为2U，酶切温度和时间为37C30 min，电泳方法参见6.4.4。7 结果表述7. 1 芸豆特异基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出芸豆成分，结果表述为样品中检测出芸豆成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常。7.2 莲蓉内源基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而芸豆特异基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出芸豆成
14、分，结果表述为样品中未检测出芸豆成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常。4 f 、s;. . 、.，GB/T 23814-2009 A.1 芸豆特异基因扩增序列(194bp) 附录A(资料性附录)扩增片段序列CAGACATTTC ATATCCAGGG AGGAACATGC TATTCGTTTG GCGAAGACTA TGGACGATCA GAATTAAAGG GTGGTGGGGC CCATAAGTTT GATCAGCATG CTGTTTGGAC TGTAAACAAA CACAGGTAGC AGCATCACTC GCAGTCTCGT TGTCACCTCC ACGCAGATAG CGCCATCCTT CACCGTACAA TTCA A.2 莲子特异基因扩增序列(142bp) GTAGAATCGG CACTGGAGGT AGCCGGCCAG GTGGCAGGTA CATCAGTATC AACCTCACCC CTTCCGT A T A GTGCCATGGC AAGCCAATGT GAGGCCCT AG GCACAGGAAC AAGGAAGAAG CTGTCTAGTT GGTTAGCCCA TG 5
