1、ICS 65. 020.30 B 41 道B中华人民共和国国家标准GB/T 28630.3-2012 自斑综合征(WSD)诊断规程第3部分:原位杂交检测法2012-07-31发布Diagnostic protocols for white spot disease一Part 3 :In situ hybridization method 中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会2012-11-01实施发布GB/T 28630.3-2012 目。吕GB/T 28630(白斑综合征(WSD)诊断规程分为五个部分z-一第1部分:核酸探针斑点杂交检测法;一一第2部分:套式PCR检
2、测法;一一第3部分z原位杂交检测法;第4部分z组织病理学诊断法;第5部分:新鲜组织的T-E染色法。本部分为GB/T28630的第3部分。本部分按照GB/T1. 1 2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本部分起草单位z中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。I GB/T 28630.3-2012 1 范围自斑综合征(WSD)诊断规程第3部分:原位杂交检测法GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征原位杂交检测法所需试剂
3、与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于进行对虾及白斑综合征的其他敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估和疾病的确诊。不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。GB/T 28630. 1 2012 白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分z核酸探针斑点杂交检测法GB/T 28630. 42012 白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分z组织病理学诊断法3 原理3. 1 白斑综合征的病原和病理学特征见GB/T28
4、630. 42012的2.103.2 技术原理原位杂交检测方法是以非放射性标记物地高辛(DIG)标记的白斑综合征病毒(WSSV)核酸探针与存在于切片中的WSSVDNA进行核酸分子杂交，并通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应在组织切片上显示出WSSV的存在位点。原位杂交可完整保持组织与细胞形态，能在复杂组织中对单一细胞进行病毒检测，准确反映组织细胞中病毒的分布。4 试剂和材料4. 1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。4.2 核酸探针按GB/T28630. 1 2012中6.2的规定。4.3 碱性磷酸酶偶联的DIG抗体CAP-抗DIG，0.75
5、U/p.L, 4 .C):生化试剂。4.4 二甲苯。4.5 元水乙醇。4.6 95%乙自事。4.7 中性树胶z生物染色用。4.8 石蜡(熔点52.C54 .C):切片级。4.9 戴维森氏AFACDavidsons AFA)固定液:见附录A的规定。1 GB/T 28630.3-2012 4.10 80%乙醇:见附录A的规定。4.11 70%乙薛:见附录A的规定。4.12 50%乙醇:见附录A的规定。4. 13 500g/mL多聚赖氨酸:见附录A的规定。4.14 2XSSC:见附录A的规定。4.15 1XSSC:见附录A的规定。4.16 0.5XSSC:见附录A的规定。4.17 TNE:见附录A的
6、规定。4.18 100g/mL蛋白酶K:见附录A的规定。4.19 0.4%甲醒z见附录A的规定。4.20 杂交缓冲液:见附录A的规定。4.21 缓冲液1:见附录A的规定。4.22 缓冲液ll:见附录A的规定。4.23 缓冲液ill:见附录A的规定。4.24 缓冲液N:见附录A的规定。4.25 显影液z见附录A的规定。4.26 0.5%悍斯麦棕YCBismarl军brownY):见附录A的规定。4.27 阳性对照为受WSSV感染且组织病理学上有明显WSSV病灶的对虾组织切片(未脱蜡)。4.28 阴性对照为未受WSSV感染且经原位杂交证明为阴性的对虾组织切片(未脱蜡。5 器材和设备5. 1 石蜡切
7、片机:满足4m7m厚度的石蜡连续切片要求。5.2 水浴锅z室温至100.C，上下波动1.C。5.3 显微镜z带高倍镜(40X)和油镜(100X)。5.4 微量移液器z量程0.5L10L、5L40L、40L200L、200Ll000L各l支。5.5 普通冰箱z具冷藏箱，并带-18.C以下冷冻箱体。5.6 程控组织脱水机或使用于工脱水步骤。5. 7 石蜡包埋机或使用于工包埋步骤。5.8 程控切片染色机或使用于工染色步骤。5.9 切片保湿孵育箱z室温至50.C，上下波动1.C或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中。5. 10 展片水浴锅z敞口，元盖水浴锅或使用自制保温盒内加一定温度的水代替。5. 11
8、平板烘片机z室温至100.C或使用恒温箱代替。5. 12 切片染色杯。5.13 医用慑子。5.14 毛笔。5.15 玻片架。5.16 吸管。5.17 载玻片。5.18 盖玻片。5.19 吸水纸。5.20 暗盒=可用任何能避免强光直射的盒子。GB/T 28630.3-2012 6 操作步骤6. 1 组织切片制备6. 1. 1 样品采集的要求、固定方法和修整取材见GB/T28630. 4-2012中附录B的规定。6. 1. 2 样品按GB/T28630. 42012中5.25. 5的规定将样品在程控组织脱水机中进行脱水、透明、浸蜡，在石蜡包埋机上进行包埋，用石蜡切片机进行切片，切片厚度5mo用毛笔
9、将切片移入展片水浴锅内展片，用已预包被500g/mL多聚赖氨酸的载玻片捞出，置于平板烘片机上65oC烘烽45mino 6.2 原位杂交6.2. 1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(3次，5min/次)、无水乙醇(2次，1min/次)、95%乙醇(2次，10s/次)、80%乙醇(2次，10s/次)、50%乙醇(1次，10 s/次)，然后用蒸馆水冲洗6次(勿让切片干燥)。6.2.2 组织切片置于TNE中5min，而后平放在切片保湿孵育箱中，吸取500L100g/mL蛋白酶K榕液，加于每张组织切片上，37oC孵育15mino 6.2.3 把组织切片上的蛋白酶K溶液
10、吸干，然后将其放人预冷到4oC的0.4%甲醒溶液中浸5mino 6.2.4 室温下，用2XSSC浸洗组织切片5mino 6.2.5 把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，吸500L杂交缓冲液于每张组织切片上，42.C孵育30 mino 6.2.6 按每毫升杂交缓冲液中加入1L4L核酸探针的用量取核酸探针置于一只微量离心管中，在100.C沸水中将含核酸探针溶液的离心管煮沸10min，然后置于碎冰中津冷。6.2.7 将上述核酸探针与相应量(每张切片应500L)的杂交缓冲液混合，吸取500L混合液于每张组织切片上，置于90.C95 .C平板烘片机上保温6min 10 min，使组织DNA变性。注意补充切
11、片上过度蒸发的杂交缓冲液。6.2.8 把组织切片放在平整的冰上津冷5mi血n6.2.9 在切片保湿孵育箱内4毡2oC下孵育16hl四8h。6.2. 10 用缓冲液2X SSC (1 5 min，室温)、1X SSC (5 min，室温)、o.5XSSC (1 5 min , 42 .C)、0.5XSSC (1 5 min , 42 .C)、缓冲液1(5 min，室温)洗组织切片。6.2. 11 用缓冲液E封闭组织切片(500L/片)，370C温浴30mino 6.2.12 用缓冲液E将AP-抗DIG稀释至0.75U/mL(1LO.75U/LAP-抗DIG加到1mL缓冲液E中)，把组织切片平放在
12、湿盒中，每片吸250L已用缓冲液E稀释的AP-抗DIG于组织切片上，37oC 温浴30min。6.2. 13 用缓冲液1(2次，10min/次，室温)、缓冲液ill(1次，5min，室温)洗玻片。6.2. 14 吸500L显影液于每张组织切片上，室温下黑暗中放置1h3 h。中间可取出短时间在显微镜下观察显色情况，当阳性对照有明显显色时可中止反应，如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特异性显色，则应立即终止显色。6.2. 15 室温下把组织切片置于缓冲液凹中15min终止反应。6.2. 16 组织切片上滴加双蒸水(1次，10s/次)、0.5%f.卑斯麦棕Y(1次，1min/次)、95%乙醇(3次
13、，10 s/次)、无水乙醇(3次，10s/次)、二甲苯(4次，10s/次)。6.2.17 滴加2滴中性树胶封片。6.2.18 在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色的细胞内沉淀物并拍照。3 GB/T 28630.3-2012 7 结果判定7. 1 受wssv感染的细胞显示阳性反应，即细胞核内有较深的蓝黑色颗粒沉淀，而阴性结果则元此沉淀。感染程度越深，则着色越明显。对虾甲壳上的显色是非特异性反应所致，如果加有核酸探针和杂交缓冲液的切片在90.C95 .C平板烘片机上保温6min10 min过程中，因缓冲液蒸发而使组织干燥，干燥部分也会出现非特异性反应。7.2 阳性对照样品不显阳性反应或阴性对照样品出现
14、与阳性显色反应程度相当的非特异性反应，判断检测结果元效，重新取样检测。4 附录A(规范性附录)试剂配方A.1 20xSSC 氯化铀拧朦酸三铀.2HzO加水溶解定容至调节pH至高压蒸汽灭菌后，室温贮存。A.2 2 xSSC 20XSSC 水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存。A.31xSSC 20XSSC 水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存。A.4 0.5xSSC 20XSSC 水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4c贮存。A.5 10 x缓冲液ITris 氯化铀加水溶解至用浓盐酸调节pH至加双蒸水定容至高压蒸汽灭菌，40C贮存。175.32 g 88.23 g 1000 mL 7.0
15、 100 mL 900 mL 50 mL 950 mL 50 mL 1 950 mL 121. 1 g 87.7 g 800 mL 7.5 1000 mL GB/T 28630.3-2012 5 GB/T 28630.3-2012 A.6 缓冲液I10X缓冲液I水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存。A.7 10 X缓冲液ETris 氧化铀加水溶解至用浓盐酸调节pH至六水氯化镜(MgCb 6H20) 加双蒸水定容至混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存，出现沉淀后丢弃。A.8 缓冲液E10X缓冲液E7lmL 950 mL NFONi的.0的NH阁。华人民共和国家标准自斑综合征(WSD)诊
16、断规程第3部分z原位杂交检测法GB/T 28630. 3-2012 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销告开本880X 1230 1/16 印张1字数20千字2012年11月第一版2012年11月第一次印刷峰书号:155066. 1-45622 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28630.3-2012 打印日期:2012年12月11日F008AOO
