1、ICS 65.120 B 46 道圈中华人民共和回国家标v准G/T 28642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法Rapid determination of Salmonella spp. in animal feeding stuffs一PCR method 2012-07-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会2012-11-01实施发布lJ ,- I=t 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位:农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心
2、(沈阳)。本标准主要起草人:张秀芹、张建勋、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月。G/T 28642-2012 I GB/T 28642-2012 i! 1 范围饲料中沙门氏茵的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法本标准规定了饲料中沙门民菌的快速检测的PCR方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法GB/T 14699.1饲
3、料采样GB 19489实验室生物安全通用要求SN/T 1193 基因检验实验室技术要求SN/T 1870食品中致病菌检测方法实时PCR法3 原理利用沸水浴使菌体细胞破裂，释放基因组DNA，离心使细胞壁等有形物沉淀，以卜清液为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。4 试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求。4. 1 沙门民菌检测用引物(对)序列为:Sal F:5-TCG CAC CGT CAA AGG AAC CGT AAA GC-3 Sal R:5-GCA TTA TCG ATC AGT ACC AGC CGT CT-3 4.2 Premi
4、x Taq缓冲液(2X):内含TaqDNA聚合酶1.25 U/25L，4 mmol Mg2十，dNTP各0.4mmol。4.3 琼脂糖z电泳级。4. 4 Marker 20000 4.5 缓冲蛋白脏水(BPW):见A.1。4.6 大豆蛋白陈肉汤(RV曰:见A.2。4. 7 亚晒酸盐肮氨酸增菌液(SC):见A.304.8 10倍上样缓冲液ClOXloadingbuffer) :0. 05%的澳酣蓝，50%丙三醇溶液，1%的SDS。4.9 质控菌株z沙门氏菌阳性标准菌株。4.10 50XTAE缓冲液=见A.40 1 d a GB/T 28642-2012 4.11 XTAE缓冲i嚷:见A.5 ,
5、4.12 澳化乙链(5mg/mL):见A.60注. 2和毛8缓冲液为商品化成品e以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代。5 仪器设备5. 1 PCR仪。5.2 恒温水洛锅。5.3 离心机z离心转速12000 g。5.4 微量移液器。5.5 电泳仪。5.6 凝胶成像仪。5.7 天平:感量0.01g。5.8 电热恒温培养箱。6 试样选取与制备按照GB/T14699. 1采样，将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用，注意整个过程中不要将样品人为污染。7 检验步骤7. 1 样晶的增菌及模板的制备取25g样品于225mL的缓冲蛋白脏水(BPW，4.5)中，37.C士1.C培养18h
6、土2h进行预增菌，取0.1 mL预增菌液转移至10mL大豆蛋白豚肉汤(RVS，4.6)培养基内，41.5.C士1.C培养24h士3h。同时取10mL预增菌液于100mL 亚晒酸盐脱氨酸增菌液(SC，4.7)中37.C士1.C培养24h士3h，进行选择性增菌，取选择性增菌液1mL于离心管中10000g离心10min，弃上清，1mL元菌去离子水悬浮离心10min，弃上清，再用0.2mL元菌去离子水悬浮，95.C水浴20min，将离心管迅速转移至冰浴中使其迅速冷却，用涡旋仪混匀裂解物，20.C25 .C下10000g离心3min，转移上清至新鲜管中备用(模板制备可选用商业试剂盒)。检测过程中分别设阳
7、性对照和阴性对照，用添加抄门氏菌阳性标准菌株的样品作阳性对照，用不含沙门氏菌的样品作阴性对照。7.2 PCR扩增50L的反应体系，在0.2mL的反应管中，PremixTaq缓冲液(4.2)25L，模板4L，浓度为20mol/L的上下游引物各1L，去离子水19L，反应程序为:94 .C预变性2min，30个循环:94 .C变性1min , 58.4 .C退火40s , 72 .C延伸30S; 72 .C终延伸7min后4.C保存。7.3 电泳检测PCR扩增产物取1.5g琼脂糖(4.3)，于100mL 1XTAE缓冲液(4.11)中加热，充分熔化，冷至65.C左右的时候，加入10L澳化乙链(4.1
8、2)，充分混匀，根据需要在模板内放人合适的梳子，制成约5mm厚的胶块。在电泳槽中加入1XTAE缓冲液，使被面没过凝胶2mm3 mm.将6L8L的PCR扩增产物与1L10倍上样缓冲液(4.8)混合后点样，取6LMarker 2000 (4. 4)点样。5V/cm8 V/cm恒压电泳，直至澳酣蓝指示剂迁移至凝胶中部，用成像仪进行凝胶成像。2 GB/T 28642-2012 8 结果表述在阴性对照于330bp处未出现条带，而阳性对照在330bp处出现扩增条带的条件下，如待测样品在330bp处未出现相应大小的扩增条带，则可报告待测样品未检出抄门氏菌;如待测样品在相应处出现扩增条带，则为疑似阳性样品，此
9、时需用GB/T13091进行确证，最终结果以后者检测结果为准。对于疑似阳性样品，可以对其扩增产物进行测序，结果参照附录B。如果阴性对照出现条带和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行检测，并排除污染因素。9 检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193, SN/T 1870和GB19489的要求执行。10 废弃物处理检测过程中的废弃物及切可能被污染的物品均应做元害化处理。3 GB/T 28642-2012 A.1 缓冲蛋白脏水(BPW)A.1.1 成分蛋白陈氧化铀磷酸氢二铀磷酸二氢饵蒸馆水pH7.0 A. 1.2 制法附录A(规范性附录)培养基及缓冲液的
10、配制10.0 g 5.0 g 9.0 g 1. 5g 1 000 mL 按上述成分分配好，校正pH，分装于大瓶中，121oc高压灭菌20min，临用时分装在500mL无菌瓶中，每瓶225mL，或配好后校正pH，分装于500mL瓶中，每瓶225mL, 121 oc高压灭菌20min，冷却备用。A.2 大豆蛋白臆肉汤(RVS)A. 2.1 溶液AA.2.1.1 成分蛋白陈氯化铀磷酸二氢饵磷酸氢二饵蒸馆水pH7.0 A. 2.1.2 制法5.0 g 8.0 g 1. 4g 0.2 g 1000 mL 将各成分加入蒸馆水中，加热至约700C榕解。此溶液需当天使用。A.2.2 溶液BA. 2. 2.1
11、成分氧化镜蒸馆水A.2.2.2 制法将氯化镜溶于水中。4 400.0 g 1 000 mL A. 2. 3 语擅CA.2 3.1 成分孔雀绿蒸馆水. 2. 3. 2 制法将孔雀绿榕于水中。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。.2.4 完全培养基. 2. 4.1 成分溶液A溶液B溶液C. 2. 4. 2 制法0.4 g 100 mL 1000 mL 100 mL 10 mL GB/T 28642-2012 按上述比例配制，校正pH，使灭菌后pH为5.2，分装于试管中，每管10mLo 115 oC高压灭菌15 min 冰箱保存。.3 亚晒酸盐肮氨酸增菌渡(SC). 3.1 基础液. 3. 1. 1 成分
12、膜蛋白陈乳糖磷酸氢二铀亚晒酸铀蒸馆水pH7.0 . 3. 1. 2 制法5.0 g 4.0 g 10.0 g 4.0 g 1000 mL 溶解前三种成分于水中，煮沸5mi丑，冷却后，加人亚晒酸纳，校正pH后分装，每瓶1000mL。. 3. 2 L-肮氨酸溶液. 3. 2.1 成分L-胧氨酸1 mol/L氢氧化铀溶液. 3. 2.2 制法0.1 g 15 mL 在元菌环境中，用灭菌水将上述成分稀释到100mL，毋须蒸汽灭菌。5 GB/T 28642-2012 A. 3. 3 完全培养基制备基础液1 000 mL L肮氨酸溶液10 mL pH7.0 基础液冷却后，以元菌操作加L-肮氨酸溶液，将培养
13、基分装于适当容量的灭菌瓶中，每瓶100mLo 注2培养基在配制当日使用。A.4 50 X TAE缓冲液A. 4. 1 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 取二水乙二肢四乙酸二纳186.1g，加入800mL蒸锢水充分搅拌，加10mol/L的氢氧化纳调解pH至8.0，待完全榕解后，定容至1L。高压灭菌。A.4.2 制法Tris碱242.0g溶于700mL的水中，加人O.5 mol/L EDT A (pH8. 0) 100 mL，冰乙酸57.1mL, 充分溶解，用水定容至1L。A.5 1 XTAE缓冲液取20mL 50 X TAE，加水定容至1000 mL Tris-乙酸终浓度为0.04m
14、ol/L , EDTA终浓度为0.001mol/L。A.6 漠化Z链(5mg/mL) 取澳化乙链0.0500 g溶于10mL水中。6 GB/T 28642-2012 附录B(资料性附录)PCR产物测序结果沙门氏菌阳性菌株PCR产物测序结果(331bp)如下zTCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGCTGGCTTTCTCTTTCCAGTACGCTT CGCCGTTCGCGCGCGGCATCCGCATCAATAATACCGGCCTTCAAATCGGC ATCAATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAATCGGGCCG CGACTTCCGCGACGCGTT
15、CTGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTGGACC ACGGTGACAATAGAGAAGACAACAAAACCCACCGCCAGGCTATCGCCAAT AACGAATTGCCCGAACGTGGCGATAATTTCACCGGCATCAGCTTCAATCA AGATAAGACGGCTGGTACTGTCCGATAATGC NFONiN寸NH团。华人民共和国家标准饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法GB/T 28642-2012 国中争6中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室，(010)64275323发行中心，(010)51780235读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数14千字2012年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年11月第一版除书号:155066. 1-45619定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28642-2012 打印日期:2012年12月11日F008AOO
