1、ICS 13.300; 11. 100 A 80 道国中华人民共和国国家标准GB/T 28646-2012 化学晶体外哺乳动物细胞微核试验方法Chemicals-Test method of mammalian ceIl micronucleus in vitro 2012-07-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-12-01实施发布GB/T 28646-2012 -=目前本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准同经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.487(2010)(体外哺乳动物细胞微核试验)(英文版)技术性内容一致
2、。本标准做了下列结构和编辑性修改z一一将OECD487原文中的简介和初步考虑部分内容作为本标准的引言气一一将OECD487原文中附录:定义中的部分内容作为本标准中的2术语和定义;二二增加了范围一章。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位=中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:孙金秀、曲波、林铮、李雪飞、白羽、王晓兵、李醋。I GB/T 28646-2012 引_._ 仨写本试验的目的是通过检测处于间期细胞的胞质中微核(micronuclei，MN)形成
3、的频率，评价受试物的遗传毒性。微核可来源于无着丝粒的染色体断片或在细胞有丝分裂后期不能迁往细胞两极的整条染色体。该试验用于检测在细胞暴露受试物期间或暴露后受试物对经历过分裂的细胞诱发断裂和非整倍体作用的活性1飞本标准规定在制定的操作规范中允许使用和不使用细胞胞浆移动阻断剂一一-松胞素B(cytochalasinB , cyto B)两种方式进行试验。在细胞有丝分裂期前加入cytoB，可阻断细胞质分裂，使细胞为双核细胞C叫，从而可在完成了一次细胞分裂的细胞中进行微核的识别以及微核发生率的选择性分析。如能提供所分析的细胞群发生了有丝分裂的证据时，可按不使用cytoB进行试验操作。另外，使用本方法除
4、了可以鉴定化学物诱发微核外，还可应用胞浆移动阻断剂、着丝点免疫标记、和着丝粒/末端着丝粒探针杂交技术(原位免疫荧光杂交技术，fluorescencein situ hybridisation , FISH) , 提供染色体损伤和微核形成机制的信息巳-16。在观察到微核形成增加，并希望确定这种增加是断裂作用还是诱发非整倍体作用，可应用标记和杂交的技术进行操作。微核损伤是可以传递到子细胞的，而分裂中期细胞出现的染色体畸变是不能传递到下一代细胞;由于所检测到的间期细胞微核是比较客观的，因此试验人员只需要测定细胞是否经过了分裂，以及含微核的细胞有多少。所以，标本的制备、分析记录相对比较迅速，而且也能实
5、现自动化分析P这使原来只能对每个处理组计数分析数百个细胞增加到数千个细胞，从而增加了试验方法的检测效力。最后，如果微核来源于滞后的整条染色体，本方法可对使用传统的染色体畸变分析(OECD473)存在困难的诱发非整倍体作用的化学物进行检测分析问。但是，如果不使用FISH等特异性技术，体外微核试验是不能鉴别化学物是诱发多倍体剂还是断裂剂。体外微核试验是在试管内体外条件下使用培养的人体或啃齿类细胞进行的试验。由于本试验同时能检测到非整倍体剂作用和断裂剂作用，因此可为探讨体外条件下染色体的潜在损伤作用提供综合基础。体外试验通常需要使用外源性代谢活化系统。外源性代谢活化系统不能完全模拟体内代谢条件。应注
6、意避免存在影响化学物固有的致突变活性的因素，如pH值、或渗透压的明显改变、或者是在高浓度下引起严重细胞毒性的条件进行试验，以免发生假阳性结果。为了分析诱发微核作用，最关键的是处理组和对照组培养物的细胞核必需已经经历过或完成了核分裂。计数微核最有利的时期是受试物处理期间或处理后细胞已经完成一个有丝分裂的阶段。体外微核试验应用多种细胞类型进行试验都是非常有效的，无论是在用或不用cytoB处理的情况下d日已经有大量的研究资料表明体外微核试验应用各种啃齿类细胞株(CHO、V79、CHL/IU和L5178Y)和人体淋巴细胞都被确认是非常有效的囚，193110其中包括，特别是由遗传毒性技术科学委员会(So
7、cit Franaise de Toxicologie G垂ntique，SFTG)主持的国际有效性合作研究8，19-22和国际遗传毒性试验工作组的报告。已有欧盟替代方法有效性4，16的欧洲中心(EuropeanCentre for the Validation of Alternative Methods , ECV AM)一项权重证据回顾性的有效性研究所作的再评价的资料白，3日4，并且该组织的专家顾问委员会(ECVAMScientific Advisory Committee, ESAC)认为体外微核试验是科学有效的。已经有使用TK6类成淋巴细胞系町、HepG2细胞株36-37和叙利亚地鼠
8、胚胎细胞的报告阳，尽管这些细胞尚未进行有效性研究。E GB/T 28646-2012 化学晶体外哺乳动物细胞微核试验方法1 范围本标准规定了化学品体外哺乳动物细胞微核试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于化学品体外哺乳动物细胞微核试验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 非整f音体诱导(荆)aneugen 通过与细胞有丝分裂和减数分裂周期相关的成分相互作用，引起细胞或生物体非整倍染色体形成的任何物质(非整倍体诱导剂)或过程。2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2. 7 2.8 非整倍体aneuploidy 染色体数与正常二倍体(或单倍体)染色
9、体数不同，其数目或是单条或多条的染色体的增多或减少，而不是整套染色体的偏移，整套染色体的改变为多倍体。细胞凋亡apoptosis 是细胞的程序化死亡，其特点是细胞经一系列连续的崩解步骤变成被膜包围的微粒，然后被吞噬细胞吞噬或蜕落排除。细胞增殖cell proliferation 作为细胞有丝分裂的结果，细胞的数量增加。着丝粒centromere 一条染色单体内的两条染色单体连接在一起的脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicacid ，DNA)区域。断裂CjflJ ) c1astogen 能够引起细胞群或生物体的染色体结构畸变的任何物质或过程。细胞浆分裂cytokinesis 细胞核在有
10、丝分裂或减数分裂后形成两个子细胞的胞浆分离过程。胞浆移动阻断增殖指数cytokinesis-block proliferation index , CBPI 胞浆移动阻断剂处理组的细胞群的激发分裂细胞数与未处理的细胞群对照的比率。1 GB/T 28646-2012 2.9 细胞分裂停滞cytostasis 细胞生长增蕴抑制2.10 细胞毒性cytotoxicity 对细胞结构或功能的有害作用，最终可致细胞死亡。2. 11 遗传毒性.genotoxicity 涵盖DNA和染色体所有损伤的一般性术语，包括断裂、加合物、再排列、突变、染色体畸变和非整倍体。不是所有的遗传毒性作用都会导致突变或稳定的染
11、色体损伤。2. 12 着丝点kinetochore 在细胞分裂期间纺锤丝与染色体的着丝粒相聚合，使子细胞的染色体有规则地向两个子细胞极端移动的含蛋白的结构物。2. 13 微核micronuclei 从细胞主核分离并独立于细胞主核的小核，由在细胞有丝分裂或减数分裂末期遗留在胞质内的染色体片段或整条染色体形成。2. 14 2.15 2. 16 2.17 2.18 2. 19 2.20 2.21 2 有丝分裂指数mitotic index 中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值，是一项反映细胞增殖程度的指标。致突变mutagenic 基因上的DNA碱基对序列或染色体的结构(染色体畸变)产生了可遗传的改
12、变。不分离non-disj unction 配对的染色单体不能拆开和不能分开到子细胞中，结果子细胞中的染色体数目异常。多倍体polyploidy 细胞或生物体中整套的染色体数目畸变，与单条染色体或多条染色体(非整倍体)不相同的。增殖指数prolif eration index, PI 不使用cytoB时测定细胞毒性的方法。(见附录A的公式)细胞计数增加比率relative increase in cell count, RICC 不使用cytoB时测定细胞毒性的方法。(见附录A的公式)细胞群倍增比率relative population doubling, RPD 不使用cytoB时测定细胞毒
13、性的方法。(见附录A的公式)复制指数replication index, RI 在暴露期和恢复时处理组完成的细胞分裂与未处理的对照相比所占的比率。(见附录A的公式)GB/T 28646-2012 3 试验原理人体和哺乳动物来源的细胞体外培养，在加和不加(所使用的细胞对所研究的受试物具有足够的代谢能力外来的代谢活化系统情况下暴露于受试物。试验时均设平行的溶剂/载体对照和阳性对照。在暴露受试物期间、暴露后细胞经足够的时间生长，能让在细胞间期由受试物造成的染色体或纺锤体的损伤形成微核。测定诱导非整倍体作用应在有丝分裂期间接触受试物。只对在暴露期间或在暴露后完成有丝分裂细胞微核进行分析。在培养物进行胞
14、浆移动阻滞处理时只计数双核细胞的微核，未进行胞浆移动阻滞处理的应证实所分析的细胞在暴露期间和暴露受试物后已经进行了细胞分裂。所有的操作，都要证明处理组和对照组的培养物的细胞发生了细胞增殖，并对分析微核培养物(或平行培养物)由受试物引起的细胞毒性或细胞停滞程度进行评价。进行体外试验一般需要使用外源性代谢活化系统，除非试验所用的细胞对受试物具有代谢活化能力。外源、性代谢活化系统是不能完全模拟体内的条件;应当注意避免出现如pH值和渗透压的明显改变;或者严重的细胞毒性39叫。如果受试物加入培养介质后引起了的pH值的变化，应当首选缓冲液的储备液调整pH值，使所有的试验浓度组与对照组的试验液体的体积相同。
15、为了对微核诱导作用进行分析，需要处理组和非处理组的细胞核发生分裂;计数微核最为适当的阶段是在受试物处理期间或处理后细胞已经完成了一次有丝分裂之后。4 试验方法4. 1 准备4. 1. 1 细胞原代培养人体外周血淋巴细胞白.19.钮，叫和啃齿类细胞株(如CHO、V79、CHL/IU和L5178Y)都可以使用的18-22.2日BJ010使用其他细胞株和细胞类型应根据本标准规定可接受的条件说明其合理性。由于微核发生的背景频率可影响到试验方法的敏感性，建议试验中使用微核背景频率较低、稳定的细胞类型。使用人体外周淋巴细胞，应当从年轻的(年龄18岁35岁)、健康的、不吸烟的、近期未暴露已知的遗传毒性化学物
16、和放射性的个体获得;如果从一个以上的供血者得到的细胞混合使用，应当说明供血者的数量;女性的微核频率随着年龄增加而增加的现象要比男性更为明显间，因此在选择混合使用的供血者时应予以注意。4.1.2 培养基和培养条件细胞培养时应使用合适的培养基和培养条件(如培养皿、CO2浓度、温度和湿度)。使用已建系的细胞株应当常规地对其染色体数目的稳定性和是否有支原体污染状况进行检查验证。不应使用含有支原体污染或染色体数目改变了的细胞株。掌握本试验室培养条件下所使用的细胞的正常细胞周期时间;如用胞浆移动阻断剂处理细胞，其使用浓度应根据所特定使用的细胞类型进行优化，并能产生良好的便于分析的双核细胞。4. 1.3 培
17、养细胞和cytoB的制备4. 1.3. 1 已建系的细胞株:从干培养物中取出进行细胞增殖F使收获前不影响单层细胞的覆盖度或者在悬浮培养时不产生过量细胞密度来进行接种，并在37.C培养。4. 1. 3. 2 淋巴细胞:用抗凝剂(如肝素)处理的全血，或是分离得到的淋巴细胞，在暴露受试物和加人3 GB/T 28646-2012 cy10 B之前在含有促细胞分裂剂如植物血时提集素(phyioha巳lTlgglutinin，PHA)的培养基中进行培养。4. 1. 4 代谢;吉化当选用的细胞缺乏内源性代谢能力时需使用外源性代谢活化系统。最常用的活化系统是从经酶诱导物如Aroclor125445-46J、或
18、是苯巴比妥与秦黄酣混合物处理的啃齿类动物肝脏后线粒体Cpost-mitochondrial)组分CS9)再加其他辅助因子组成46-49J。诱导时，后者更符合关于持久性有机污染物斯德哥尔摩公约的规定间，并被证明在诱导混合功能氧化酶上与Aroclor1254同样有效46-49J。S9组分在培养基中的终浓度一般为体积分数1%10%。代谢活化系统的使用可能取决于受试物的种类，在某些情况下可能需要使用一种以上的S9的浓度。经遗传工程构建的可以表达人类或啃齿类动物特异性活化酶的某些细胞株可能不需要外源物活化系统，可以作为试验细胞;但应当取得这些特异性活化酶与受试物代谢的混合功能氧化酶之间存在关联性，以及他
19、们在对己知的断裂剂和诱发非整倍体剂的所起的作用等证明是有科学依据的町。研究者应当清楚受试物可能不会被表达的混合功能氧化酶所代谢，此时所得到的阴性结果并不表示受试物不具有诱发微核的作用。4. 1. 5 受试物的准备固体的受试物应当榕解在适当的溶剂和载体中，然后在暴露处理细胞前再进行适当的稀释;液态的受试物可以直接/或在处理细胞前经稀释加入到试验体系中F气态或挥发性受试物的蒸气要对标准操作程序做适当修改，如在密闭容器中进行暴露处理等52-町。试验时应使用新鲜配制的受试物，如有制备物的稳定性数据证明储存物是可接受的，仍可使用储存的制备物。4.2 试验条件4.2. 1 溶剂/载体溶剂/载体不应当与受试
20、物发生反应，或所使用的浓度不能影响细胞的存活或影响S9活性的维持;不使用己为大家接受的溶剂/载体(如水、培养基、二甲基亚酬)而使用其他潜剂/载体，要有资料支持这些溶剂与受试物相适合，并不具有遗传毒性。推荐尽可能地首选水作为榕剂/载体。4.2.2 使用cytoB 作为胞浆移动阻断剂4.2.2.1 进行体外微核试验时要确保所分析计数微核的细胞是在暴露处理期间或在处理后的培养期间已经完成了有丝分裂的细胞。cytoB是一种广泛应用的胞浆移动阻断剂。推测其通过抑制肌动蛋白的集结组合作用，在有丝分裂后可阻止两个子细胞的分离，导致双核细胞的形成白，54-5飞所以微核的计数分析只限定对在处理期间或处理后经过了
21、有丝分裂的细胞。应同时测定受试物对细胞增殖动力学的影响。还有已经使用的其他方法用于确定所分析的细胞是否已经发生分裂。当使用人体淋巴细胞进行试验时，规定应使用cytoB进行处理，这是因为培养物内彼此之间和供血者之间细胞周期时间互不相同，也因为不是所有的淋巴细胞都对PHA发生反应。4.2.2.2 cyto B的合适浓度一般为3g/mL6g/mL。试验室应测定每种细胞类型使用cytoB合适浓度，以保证在溶剂/载体对照组中获得理想的双核细胞频率。4.2.3 染毒浓度、细胞增殖和细胞毒性的测定4.2.3. 1 当选择最高浓度时，应避免引起假阳性反应的浓度，如过度的细胞毒性、在培养基中出现沉淀、pH值和渗
22、透压的明显改变等问叫。GB/T 28646-2012 4.2.3.2 测定细胞增殖，证实暴露处理的细胞在试验期间发生有丝分裂，并保证暴露处理是在引起适当的细胞毒性水平进行。在不使用cytoB时，对不需代谢活化的细胞进行试验，应测定外加和不加代谢活化系统条件下的细胞毒性，其指标是RICC、RPD(见附录A)。在使用cytoB情况下.可以通过测定复制指数来表示细胞毒性。4.2.3.3 用cytoB处理培养的细胞，测定培养物中单核、双核和多核细胞相对出现频率可提供暴露处理对细胞增殖作用、细胞毒性和细胞停滞作用的准确的定量町，并能确保只对暴露处理期间和处理后发生分裂的细胞进行分析计数。在使用cytoB
23、的试验中，细胞停滞/细胞毒性可以由CBP1来进行定量5.2656;或者通过每个培养物至少500个细胞推算出来的R1来定量(见附录A)。此时对细胞的增殖评价，也是通过对每个培养物至少500个细胞来测定推算CBP1或R1。还可以通过对处理和对照培养物的一些测定得到的量值大小进行比较来估算细胞毒性。评估细胞毒性的其他标志，如细胞覆盖程度(confluency)、细胞数量、细胞凋亡、坏死变性、中期相数等都可以提供有价值的信息。在不使用cytoB的试验中，应证明所计数的细胞在暴露处理期间或处理后已发生了有丝分裂，否则可能得到假阴性反应的结果。证实细胞发生了分裂的方法，可用5】澳脱氧尿嘈睫(也Br时dU)
24、掺入细胞后并对其进行测定，鉴别出已发生了复制的细胞臼5对来源于耐受细胞株形成的克隆进行处理，可在显微镜下进行原位观察分析得到P凹I2H8;或测定RPD，或R1CC;也可使用文献口1川录A)o评估细胞毒性和细胞停滞的其他标志，如细胞覆盖度、细胞数量、细胞凋亡、坏死变性、中期相数量等都可以提供有价值的信息。4.2.3.4 至少要评价3个可供分析的试验浓度组。为此，应设多个组距较近的浓度组，根据各浓度组微核形成情况，得到引起细胞毒性适宜的浓度范围;也可进行细胞毒性预试验来缩窄最后进行试验的浓度范围。最高浓度组的细胞毒性发生率应控制在55%土5%;较高的浓度水平应达到能因细胞毒性而继发产生染色体损伤;
25、要求所设试验浓度出现细胞毒性发生率应涵盖从引起55%土5%到引起轻微或没有细胞毒性的范围。4.2.3.5最高试验浓度，如没有过高细胞毒性和受试物过浓而沉淀析出等，应当达到0.01M, 5 mg/mL或5L/mL。可以任何一个浓度作为最低的浓度组叫;一般情况下所选择的进行分析的浓度的组间距应不要超过.;ro;出现较陡峭的剂量-反应曲线的受试物，其浓度组距的设置应当比较密，这样对中、低浓度组也能进行计数分析。4.2.3.6 如受试物最高浓度的细胞毒性未超过规定的上限，而受溶解性所限，此时最高浓度应达到培养物中可见到极少沉淀的浓度作为最低浓度，当然这个浓度不应当干扰计数分析。可用光学显微镜来评价沉淀
26、物的状态，说明沉淀是持续存在的还是培养期间(处理结束)产生的。4.2.4 对照4.2.4.1 每个试验都应同时设加和不加代谢活化系统的阳性对照组和阴性对照组(溶剂/载体对照组)。4.2.4.2 阳性对照物:为了证实对所用细胞的作用能力、试验方案的正确性、是断裂剂还是诱发非整倍体剂、S9制备物的代谢活化能力等都需要设阳性对照。阳性对照物应当是已知的给予尽可能少的量就能诱发微核形成的物质，其诱发的超过微核形成背景频率范围的增加是可重复的，并要证实试验系统对阳性物的敏感性。阳性对照物的浓度应达到引起明确作用的浓度，但是不能让阅片人直接认出标本是哪一组的。4, 2.4.3 应当使用需要代谢活化的断裂剂
27、(如环磷酷股，苯并蓝)来证实试验系统的代谢活化能力和试验系统对断裂剂的检测能力。如果有根据也可使用其他阳性对照物。由于某些需要代谢活化的阳性对照物，在某些处理条件下或者在某些细胞株在没有外源性代谢活化系统下也可被活化，因此要求在所用细胞株和设定试验浓度下对代谢活化作用和S9制备物的活性进行试验。到目前为止，还没有已知的非GB/T 28646-2012 整干吉f本诱导?我!需要代谢活化才能发挥遗传毒忡作用，1叼A现在可以使用的非整倍佯洁性阳性对照物有秋水仙素(colchicine)和长春碱(vinblastine)。对只诱发微核，元论是原发的还是通过非整倍体活性产生的微核作用的其他物质，也可以作
28、为阳性物性胃口在不加活化系统时为了避免设景两种作用的阳性对照(断裂作用和诱发非整倍体作用)，诱发非整倍体作用的对照可以作为不加S9的阳性对照，断裂作用的对照可以作为试验所用代谢活化系统活性是否合适的阳性对照。能同时作为断裂作用和诱发非整倍体作用的阳性对照物，应当使用不需要S9的细胞株进行试验。推荐使用的阳性对照物名单见附录B。4.2.4.4 使用其他的阳性对照物应说明理由。应考虑到按照化学品类别选择阳性对照物E所有阳d性对照物都应当与试验用的细胞类型和活化条件相适合。4.2.4.5 每次试验应设只含溶剂/载体的阴性对照组，除不暴露受试物外，处理方式与暴露组相同。另外，还应当设置未处理的(没有溶
29、剂/载体)阴性对照组，除非已有文献或实验室的历史上的对照数据能证明所选择的溶剂在所使用的浓度下没有遗传毒性和其他的可测定到的影响时，可不设定。4.3 试验步骤4.3. 1 染毒基本原则为了能最大程度的检测出细胞周期某特殊阶段诱发非整倍体或断裂剂作用，非常重要的是在细胞周期的所有阶段要有足够的被受试物处理的细胞数量。对细胞株和原代培养的细胞培养物的处理与淋巴细胞的操作有些不同，后者需要使用有丝分裂刺激剂启动细胞周期，这一操作上的不同在4.3.2也需要注意川。理论上和公开的资料时都表明在加和不加S9暴露处理3h6 h、移除受试物后，再培养1.5个2.0个细胞周期都可以检测到绝大部分的非整倍体诱导剂
30、和断裂剂。在开始暴露处理或处理结束后的大约1.5个2.0个正常细胞的细胞周期时间(如未处理的细胞周期)进行细胞采样(见表1)间。如已知或怀疑受试物对细胞周期时间有影响，采样和回收时间需要延长(例如z检测核昔类似物)。由于S9制备物可能对培养的哺乳动物细胞存在潜在的细胞毒性，应只对不加S9时把暴露处理时间延长1.5个2.0个正常细胞周期。使用和不使用cytoB都可以采用这种延长细胞暴露处理的操作。如选择使用cytoB，需注意受试物与cytoB之间会发生相互作用的可能。表l列出了建议的细胞处理的操作程序。这些通用的操作程序要根据所用细胞对受试物的稳定性和反应性，特别是所用细胞的生长特性来进行调整。
31、所有的暴露处理都应在细胞呈现指数增长期开始和结束。表1体外微核试验细胞暴露处理和收获时间+S9 在加入S9条件下细胞暴露处理3h-6 h，移去含S9和受试物的培养基;更换新鲜的培养基和cytoB，培养1.5个-2.0个正常细胞周期后收获细胞-S9 细胞暴露处理3h-6 h，移去含受试物的培养基;更换新鲜的培养基和cyto经cytoB处理的淋短期染毒B，培养1.5个-2.0个正常细胞周期后收获细胞巴细胞，原代细胞和方案A:在使用cytoB条件下，细胞暴露1.5个-2.0个正常细胞周期，在染细胞株一S9毒期结束时收获延长染毒方案B:在使用cytoB条件下，染毒1.5个-2.0个正常细胞周期，移去含
32、受试物的培养基;更换新鲜的培养基和cytoB，培养1.5个-2.0个正常细胞周期后收获细胞未经cytoB 除了不经cytoB处理外与上面的操作完全相同处理的细胞株6 GB/T 28646-2012 4.3.2 经cytoB处理的淋巴细胞，原代细胞和细胞株淋巴细胞:最有效的方法是在PHA剌激后44h48 h开始暴露受试物，此时，淋巴细胞的细胞周期不再同步向。预试验阶段应分别在加入和不加入S9条件下，细胞经3h6 h短时间暴露受试物，然后移去含受试物的培养基，替换为新鲜的含有cytoB的培养基，培养1.5个2.0个正常细胞周期后收获细胞。如果在加和不加S9的两项短期处理(3h6 h)预试验结果是阴
33、性或可疑的，随后应做一个不加凹的延长暴露处理的试验。其操作方法有两个等效的、都可接受的暴露处理方案可供选择:方案A适合PHA激发的淋巴细胞在剌激后的第96小时细胞指数增长处于衰退中的细胞;方案B适合在试验结束采样时培养皿内细胞还完成完全覆盖。方案A:细胞暴露处理受试物1.5个2个正常细胞周期，在处理结束时收获细胞。方案B:细胞暴露处理受试物1.5个2个正常细胞周期，移去含受试物的培养基，更换新鲜的培养基，继续再培养1.5个2个细胞周期后再收获细胞。原代细胞和细胞株暴露处理操作除了不需要用PHA剌激激发44h48 h之外，暴露处理的方式与淋巴细胞相似。淋巴细胞以外的其他细胞，如直到试验结束仍处于
34、对数生长期，暴露处理应当持续到试验结束。4.3.3 未经cytoB处理的细胞株在加入或不加入凹的条件下细胞应该暴露处理3h6 h，移去含受试物的培养基，更换新鲜的培养基，培养1.5个2.0个正常细胞周期后收获细胞。如果在不加入S9条件下短期暴露处理3h6 h获得了阴性或可疑的结果，那么在不加人S9的条件下延长暴露处理时间。试验操作有两个等效的，可以接受的暴露处理方案可供选择z方案A:细胞用受试物暴露处理1.5个2个正常细胞周期，在暴露处理结束时收获细胞。方案B:细胞用受试物染毒1.5个2个正常细胞周期。移去含受试物的培养基，更换新鲜的培养基，继续培养1.5个2个细胞周期后再收获细胞。在培养物的
35、单层细胞层中，在暴露处理3h6h结束时会有丝分裂的细胞出现，这些呈圆形的分裂细胞使用常规的方法是可以识别的，也容易从器皿表面脱落分离;因为这些有丝分裂细胞很容易脱落分离，因此当移去含有受试物的培养基时可能会丢失;在冲洗培养物细胞时应该注意收集可能丢失的细胞，并将其放回培养物中;收获细胞时，避免丢失这些处于有丝分裂期的最可能发生微核的细胞。4.3.4 样本数每个受试物浓度组、载体/溶剂对照及阴性对照组都应设2个平行的培养物。如果实验室的历史资料能够证明2个平行培养物间的变异非常小，那么每组只设单个培养物浓度组不设平行样也是可以接受的。如果浓度组使用单个培养物进行试验，建议增加供分析的浓度组的数量
36、。4.3.5 收获细胞与标本片制备4.3.5.1 每个培养物都应当分别单独收获细胞和制备处理。细胞样品的制备可能涉及到低渗处理，但如果观察到有足够的分散良好细胞，则不需要进行低渗处理。为了制备高质量的用于分析计数的细胞标本片可使用各种制片技术。应当固定细胞胞浆以便观察分析微核和(在使用cytoB时)对双核细胞准确可靠的辨别。标本片可用多种方法染色(如，吉姆萨、DNA特异性荧光染色)词。使用DNA特异性染色(如日丫院橙，acridineorange) 61J或Hoechst33258加派若宁-Y染色(Hoechst33258 plus pyronin_Y)62J可以排除在非DNA特异性染色的一些
37、人为的伪象。如果对微核形成的机制感兴趣可应用抗着丝粒抗体、全7 GB/T 28646-2012 幸?丝粒D队JA军4-1-1京f立荧光杂交、全着丝和特异性引物原位延伸标记、并结合适当的DNA复梁等技术来鉴别微核的成分(染色体/染色体断片)15-6J。如果受试物表现出断裂剂或诱发非整倍体等作用时，可采用其他的方法鉴别受试物是染色体断裂剂还是非整倍体诱变剂。4.3.6 分析4.3.6. 1 在显微镜分析之前，所有的标本片(包括溶剂/载体对照、阳性对照和阴性对照标本片)均应编写唯一性编号。也可使用适用于在自动流式细胞仪或图像分析系统使用的有效的编号方法。4.3.6.2 经cytoB处理的培养物标本片
38、，计数微核时每个浓度组至少要分析计数2000个双核细胞(每个浓度组的平行的两个培养物至少各计数1000个双核细胞);如果每个浓度组使用了单个的培养物，计数微核时每个浓度组至少要分析计数2000个双核细胞;如果实际计数2个平行培养物的每个培养物低于1000个双核细胞，或每个浓度设单个培养物时每个培养物低于2000个双核细胞，虽然达不到上述计数标准要求，还可以按照每个浓度进行分析计数。如未观察到微核率显著意义的增加，此时或使用较多的细胞或以毒性较低的浓度重复试验，两个方法任何一个都是可以的。需要注意不计数形状不规则的、或两个核大小差别很大的双核细胞F也不要被分散不好的多核细胞混淆误认为是双核细胞;
39、不要分析计数含有多于两个主核细胞的微核，因为在这些细胞中的微核频率背景基线比较高63叫。如果受试物表现出干扰cytoB的活性，计数单核细胞的微核也是可以接受的。4.3.6.3 在未经cytoB处理细胞株的微核试验中，微核计数应每个浓度组至少要分析计数2000个细胞(每个浓度组的两个培养物至少各计数1000个细胞);而每个浓度组只有一个培养物的试验时，每个浓度组至少要计数2000个细胞。4.3.6.4 如果使用了cytoB.应当测定CBPI或RI，评价细胞增殖情况，方法是每个培养物至少计数500个细胞(见附录A)。当暴露处理在未使用cytoB条件下，有必要提供所分析的细胞发生了增殖的证据，证实所
40、分析的细胞发生了分裂的方法见4.2.3.304.3.7 试验可接受的标准4.3.7.1 提出应用本标准所描述方法进行试验的实验室，应证实其具备应用附录B中的参考物质(阳性对照物).除了已知的阴性物质外，在加入和不加入代谢活化系统条件下，都能准确可靠地测定出已知的诱发非整倍体作用和诱发断裂作用活性的能力。此时还需实验室应提供在不使用cytoB时被计数的微核形成的细胞已经完成了一个核分裂周期的证据，作为实验室有能力正确执行本方法的证据。4.3.7.2 附录B中列出的化学物是推荐使用的参照化学物。对活性己知、诱发微核机制相同、以及表明将来会应用于体外微核试验试验的相关其他化学物可作为替代物可列入到附
41、录B中。但需要证明，在对多种物质测定中应用是有效的、或者基于受试物化学类别的专一性色谱特征、或是根据损伤机制研究的结果。4.3.7.3 溶剂/载体对照和未处理的培养物应当有重现性很好的低而稳定的微核频率(本标准规定使用的细胞典型的微核频率范围为5MN/l 000个25MN/l 000个细胞);如果在体外微核试验中使用有效，但反应范围不同的其他类型的细胞，应测定其反应频率范围F从阴性对照、溶剂和阳性对照所得到的微核率的数据资料应当用于建立历史对照数据范围。这些数据应当用于评判试验所设的同步阴性/阳性对照是否合适。4.3.7.4 如果试验使用自动分析替代手工分析计数技术，或使用了新型细胞，虽然对操
42、作规范只作较少的修改，在所修改的操作规范认为可用之前，需要证实改变的操作规范是有效的。有效性的证实包括能检测到染色体断裂、增加和丢失等主要机制、对各个不同类别的化学物的试验都能得到相应的阳性和阴性结果;或者是对大量的各种物质进行的试验。GB/T 28646-2012 5 试验数据和报告5. 1 数据处理5. 1. 1 如果使用了胞浆移动阻断技术，只观察分析双核细胞的微核发生率(单独每个细胞的微核数)用于对诱发微核作用的评价;对细胞中出现一个、两个或更多的微核虽可以提供有价值的信息，但不做强行规定进行统计分析。5. 1.2 应当对所有的处理组、溶剂/载体对照的细胞毒性和/或细胞停滞状态进行同时测
43、定阳。使用cyto B的技术处理时，测定处理组和对照组培养物的细胞周期的延迟作用，来计算CBPI和RI;在未使用cytoB的试验中，要使用相对细胞群倍比率和细胞计数增值比率这两个参数评价细胞增殖和细胞毒性。(见附录A)5. 1. 3 应提供每个培养物单个的数据资料，同时所有的数据资料都要以表格的形式进行总结。5. 1. 4 在体外微核试验中测定到诱发微核的化学物，可能成为它们诱发染色体断裂、丢失，或者两种损伤发生的原因。应用抗着丝粒抗体、全着丝粒特异性原位探针和其他的技术可进一步分析确定微核的诱发是由于断裂作用或是诱发非整倍体作用活性所致。5.2 结果评价5.2. 1 明确的阳性反应和阴性反应
44、都不要求附加其他试验来进行证实;对可疑的结果要对所有的培养物的1000个细胞进行计数分析，来进行澄清明确;如果上述操作还不能解决，应当作进一步的试验;如果试验条件的参数范围做了修改，或是扩大或是变窄了，证实合适，在以后的试验中应当采纳;可能需要修改的试验参数包括试验浓度的组间距、细胞的暴露处理和收获的时间，以及代谢活化的条件等。5.2.2 判断阳性结果有几个标准，如微核率出现浓度(剂量)相关的增加，或者含有微核的细胞计数出现有统计学显著意义的增加等。首先考虑的是所得到结果的生物学的相关性。在评价反应的生物学意义时，可以根据观察值是否在历史对照范围之内的分析来指导对结果判断评价。适当合理的统计分
45、析处理方法会对试验结果的评价提供有力帮助阳。然而，应根据剂量-反应来评价统计学检测的结果。此外，还应当考虑到试验的重现性和与历史数据比较。5.2.3 尽管大多数试验都会得到明确的阳性或阴性结果，有时根据试验数据对受试物的活性很难得出明确的判断。不管试验重复多少次，其结果仍可能是不明确的、或有疑问的，而得不出明确的判断结论。5.2.4 体外微核试验阳性，表明受试物诱发了培养中的哺乳动物细胞的染色体产生了损伤;阴性结果则表明在所采用的试验条件下，受试物未引起培养中的哺乳动物细胞染色体结构损伤、或获得或丢失等染色体数量的改变。5.3 试验报告试验报告应包括下列内容za) 受试物z受试物特征性资料和化
46、学文摘注册号;一一物理性状和纯度;与试验相关的理化特性;一一受试物与溶剂/载体或细胞培养基的反应活性。b) 榕剂/载体z一一一说明所选择溶剂/载体的合理性。受试物在溶剂/载体中的榕解性和稳定性。9 GBJT 28646-2012 c) 细胞:一一所用细胞类型和来源;所用细胞类型的适用性;一一元支原体污染的资料(如适合，可用); -一细胞周期时间、细胞数倍增时间、增殖指数z使用淋巴细胞试验时，供血者性别、年龄和供血者的人数(如适合，可用); 淋巴细胞试验时，暴露处理是全血还是分离出来的淋巴细胞;细胞传代数(如适合，可用); 细胞培养方法(如适合，可用); 一一染色体正常数目F一一正常的(阴性对照
47、组)细胞周期时间。d) 试验条件:10 一一胞浆移动阻断剂(如cytoB)的特性、使用浓度、作用于细胞的时间;一一说明选择受试物浓度及各组样本数的合理性，包括受试物对细胞的毒性作用资料、溶解度限值资料(如适合，可用); 培养基组成成分和COz浓度(如适合，可用); -一受试物浓度;-一一溶剂和所加受试物的浓度(和/或体积); 一一培养温度和培养时间;一一一暴露处理时间;暴露处理后的收获时间;接种的细胞密度(如合适，可用); 一-代谢活化系统的类型和组成及其判断可接受的标准;一一一阳性对照物和阴性对照物;一一制片和染色所用技术及方法;一一微核的识别标准p一一一观察的细胞数F试验细胞毒性的方法;其
48、他反应细胞毒性的辅助信息;判断试验结果为阳性、阴性或可疑的标准z-一采用的方法(如采用着丝粒抗体方法来判定微核是否来源于整条染色体还是染色体断片); 一一统计学分析方法。e) 结果z一一细胞毒性的试验z 如使用胞浆移动阻滞技术时，CBPI或RI数; 未使用胞浆移动阻滞技术时，细胞计数增加比率、细胞倍增比率和PI; 其他的指标，如细胞覆盖程度、细胞凋亡、细胞坏死、中期相细胞数、双核细胞频率。对培养体系析出沉淀表现的描述;用于暴露处理的培养基的pH值和渗透压资料(如进行了测定); 一一符合用于分析的细胞的定义;一一如果使用了胞浆移动阻断的方法时培养物内单核、双核和多核细胞的分布比率;一一每个暴露处
49、理组和对照组的培养物应分别计数带有微核的细胞数，并说明其是双核细胞GB/T 28646-2012 还是单核细胞如合适、可用): 一-浓度/剂量反应关系(如可能); 同步设置的阴性(溶剂/载体)和阳性对照赞料(散度/剂量和溶剂); 一-历史性阴性对照(溶剂/载体)和阳性对照资料，包括范围、均数及标准差以及置信区间(如95%置信限); 统计学分析，值(如果有)。f) 结果讨论。g) 结论。11 GB/T 28646-2012 附录A(规范性附录)细胞毒性评价公式A.1 使用cytoB时，用CBPI或RI评价细胞毒性。细胞阻滞(%)=100% -100%CBPh -lJ/CBPlc -lJ .(A. 1) 式中:T 试验化学物暴露处理组细胞;C 溶剂对照组细胞。CBPI=(单核细胞数)+ (2 X双核细胞数)十(3X多核细胞数).( A.2 ) (细胞总数)因而，一个为l(所有细胞都是单核的
