1、道BICS 13.300;11.100 A 80 和国国家标准=l:I工./、中华人民GB/T 28647-2012 化学晶E齿齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验Chemicals-Test method of uterotrophic bioassay in rodents一A short-term screening test for oestrogenic properties 2012-12-01实施2012-07-31发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会1良苦。由wh吓防SOE 叫MYMVdd .， 441阳GB/T 28647-2012
2、目IJ 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准技术性内容与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.440(2007)(啃齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验)(英文版)一致。本标准做了下列结构和编辑性修改z一一将OECD440原文中的前言和最初考虑和局限性部分内容作为本标准的引言;一一增加了范围一章;一一将OECD440原文中的附录1定义部分内容作为本标准的术语和定义;一一将OECD440原文中的附录2OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架部分内容作为本标准的附录A。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会CSAC/TC251)提出并归口。本标准起草单
3、位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:侯粉霞、曲波、王晓兵、李雪飞、自羽、李畴。I GB/T 28647-2012 51 1998年，OECD启动了一项具有高度优先权的行动，即，修订现有指南、建立用于筛查和检测潜在内分泌干扰物的新指南110行动的内容之一就是建立啃齿类动物子宫增重试验的试验指南。之后，对啃齿类动物子宫增重试验开展了广泛的验证程序，包括详细的背景文件的编辑叫以及通过应用强活性参比雌激素、弱活性雌激素受体激动剂、强活性雌激素受体拮抗剂、阴性参比化学物等作为受试物，开展广泛的实验室内和实验
4、室间的比对来说明该试验的相关性和可重复性叫。该试验指南440是在汲取了验证试验中的经验和参照了雌激素激动剂类受试物试验结果后形成的。子宫增重试验是一个始于20世纪30年代的短期筛选试验仔细，在1962年被一个专家委员会首次定为筛选试验胆，叫。它是基于子宫质量的增加或者子宫增重反应(参见5.3)，用于评价一个化学物引起与天然雌激素(例如17雌二醇，17-estradioD的激动剂或拮抗剂作用相致的生物学作用的能力。然而，该方法用于检测雌激素拮抗剂比用于检测雌激素激动剂要少得多。子宫对帷激素的反应方式有两种。最初的反应是吸收水分而引起子宫质量增加。此后，子宫组织增长进一步引起其质量增加叫。大鼠和小
5、鼠的子宫反应具有可比性。该试验是一项体内筛选试验，它的应用可参见OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架飞附录A)。在这个概念框架中，子宫增重试验作为一项体内试验位于框架的第3级，阐明单一一种内分泌作用机制，即雌激素样作用。子宫增重试验希望被纳入用于检测潜在内分泌干扰作用的系列体内和体外试验中，最终用于对人类健康和环境影响进行危险评价。OECD在开展该方法验证试验时，使用强活性和弱活性的雌激素激动剂来评估该试验检测雌激素样作用物质的效能4-8。因此，除了实验室内和实验室间良好的可重复性外，该试验用于检测雌激素样作用物质的敏感性也得到了很好的证实。在该方法的验证试验中，仅使用了一种阴性参比物，有
6、报道该种物质的子宫增重试验以及体外受体结合试验和受体检测试验为阴性。此外，也对验证试验之外的资料进行了评价，这些资料进一步证明了子宫增重试验用于筛选雌激素样作用物质的特异性。雌激素激动剂和拮抗剂作为雌激素受体和卢受体的配体，可分别活化或抑制受体的转录。这可引起潜在的健康危害，包括对生殖和发育产生影响。因此，需要快速地评价化学物是否有可能是雌激素激动剂或拮抗剂。虽然受试物与雌激素受体的亲和力、雌激素受体基因转录活化体外试验等方面的资料可提供信息，但这些信息仅是决定是否有可能产生有害作用的因素之一。其他的决定因素包括化学物进入体内后的代谢活化和失活、在各组织的分布情况、从体内清除的情况等;这些情况
7、至少部分地依赖于染毒途径和被检测的受试物。这就需要了解受试物在体内环境中的活性，除非已有资料可说明该化学物的吸收一分布一代谢一排泄的特征。子宫组织在受到雌激素剌激后发生快速增长，特别是啃齿类实验动物(其发情周期持续约4d)。啃齿类动物，特别是大鼠，被广泛应用于危害评估的毒物学试验中。因此，啃齿类动物的子宫对于体内筛选雌激素激动剂和拮抗剂是一个适宜的靶器官。本标准是基于那些在OECD验证试验中使用的试验方法，这些验证试验的结果已经表明该方法在实验室内和实验室间是可靠的和可重复的民7。现在可以利用两种方法，即切除卵巢的成年雌性动物方法Covx-adultmethod)和未发育成熟的不切除卵巢的方法
8、Cimmaturemethod) 0 OECD验证试验结果显示这两种方法有可比较的敏感性和可重复性。然而，对于未发育成熟的动物，因为其具备完整的下丘脑一垂体一性腺CHPG)轴，用于试验时其反应的特异性要差一些，但却比切除卵巢的动物检测的范围更大一些，因为它除了可用于检测作用于雌激素受体的物质，也可用于检测作用于HPG轴的物质。在大约为15日龄时，大鼠的HPG轴具有了功能。在这之前，用促性腺激素释放激素等处理不能促进E GB/T 28647-2012 青春期发育。在即将到达青春期、阴道开口之前，雌性动物将经历几个类似休眠的性周期，在这期间未引起阴道开口和排卵，但是激素水平会有波动。如果化学物直接
9、或间接地剌激HGP轴，则可引起青春期提前、早排卵和加快阴道开口。除了可作用于HPG轴的物质外，若饲料中虽然不含有雌激素物质但含有较高水平的可代谢能量，也可剌激动物发育、加快阴道口开放。上述这些物质不会引起切除卵巢的成年动物的子宫增重反应，因为它们的HPG轴没有功能。考虑到动物福利，该方法应优先使用未发育成熟的大鼠，这样可以避免对动物做手术，也可避免由于动物进入发情周期而将动物废弃的可能性(见5.4.1)。子宫增重不是完全由雌激素引起的，也就是说除了雌激素激动剂和拮抗剂之外的其他物质也可引起子宫增重。例如相对高剂量的黄体酣(progesterone)、辜酣或者各种人工合成的孕激素(progest
10、in)都可剌激子宫增重叫。子宫增重的任何改变可以通过组织学检查阴道角化而予以确定叫。不管诱发因素是什么，如果子宫增重试验结果为阳性，则一般应进一步对其起因予以阐明。其他资料，如雌激素受体结合试验和雌激素受体转录活化试验等体外试验的资料以及雌性动物青春期分析等体内试验的资料，也可用于证明雌激素样作用。由于子宫增重试验是作为一种体内筛选试验，因此，所开展的方法验证试验既要考虑动物福利的要求，又要考虑分阶段开展试验的策略。验证试验主要是为了充分证明其检测雌激素样作用(是许多化学物需要关注的方面)的可重复性和敏感性，而对其检测抗雌激素样作用仅做了少量的验证工作。仅采用了一个强活性抗雌激素物质进行了验证
11、，这是因为有明确的抗雌激素样作用(未受某些雌激素活性作用的干扰)资料的物质是很有限的。因此，本标准是针对雌激素样作用，而描述检测抗帷激素样作用的试验方法则包含在一个指南文件中。本方法用于检测单纯的抗雌激素物质的可重复性和敏感性在今后(当检测抗雌激素样作用的方法被常规使用了一段时间和使用本方法检测出了更多的抗雌激素样作用物质后会有更清楚的描述。众所周知，所有与动物有关的试验程序都应符合当地动物管理的标准F下面所述有关动物管理和处理的要求是最低标准，可被当地的动物管理要求所替代。OECD给出了仁慈对待动物的指南文件阳。与所有使用活体动物进行的试验一样，应在试验前确定是否需要开展该试验。例如在下列两
12、种情况可开展该试验:(1)潜在的暴露量大(见附录A、概念框架中的第1级)、或者其雌激素样作用结果提示需通过开展体内试验来证明这种作用。(2)概念框架中第4级或第5级的体内试验结果提示需证实所产生的效应是与雌激素机制有关的，而体外试验不能对此予以证明。E 1 范围化学晶E齿齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验GB/T 28647-2012 本标准规定了化学品啃齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法描述、试验步骤、试验数据和报告、结果的解释和认可。本标准适用于雌激素作用短期筛选啃齿类动物子宫增重试验。2 术语和定义2. 1 2.2 2.3 2.4
13、下列术语和定义适用于本文件。抗雌激素样作用antioestrogenicity 化学品抑制哺乳动物体内17卢-雌二醇Cestradiol 17卢)作用的能力。出生日期date of birth 出生后第0天。给药dosage 表示染毒剂量、染毒次数和染毒期限的一个总称。剂量dose 染毒受试物的量。对于子宫增重试验，剂量表示为实验动物每天每单位体重的受试物质量如mg/Ckg. d)J。2.5 2.6 2. 7 2.8 最大耐受剂量maximum tolerable dose , MTD 进入体内未引起实验动物死亡的受试物的最大量(用DLo表示)。雌激素样作用oestrogenicity 化学品
14、可在哺乳动物体内引起类似17乒雌二醇Cestradiol 17卢)作用的能力。出生后x天postnatal day x 出生日之后生活的第z天。敏感性sensitivity 将阳性/有活性物质检测出阳性结果的比例。是对试验方法精确性(能正确检测出不同活性的物质)的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。1 G/T 28647-2012 2.9 特异性specificity 将阴性/元活性物质检测出阴性结果的比例。是对试验方法精确性(能正确检测出不同活性的物质)的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。2. 10 子宫增重uterotrophic 描述对子宫组织增长的
15、阳性影响。2. 11 验证validation 一个科学过程，用于对一种试验方法的操作要求及其检测的局限性进行具体规定，并证明该试验方法用于某种特定检测目的具有可靠性和相关性。3 试验原理3. 1 子宫增重试验的敏感性依损于一种动物试验系统，即，动物的下丘脑垂体-卵巢轴没有功能、导致很低的内源性雌激素水平，这样的试验系统可以保证子宫维持低质量以及雌激素染毒后动物的反应达到最大范围。雌性啃齿类动物有两种雌激素敏感状态可满足上述要求，即:一一断奶之后至青春期之前未发育成熟的雌性动物;一一卵巢切除且在卵巢切除后经过了足够长的时间便子宫组织退化的初成年雌性动物。3.2 每日经口灌胃或皮下注射染毒受试物
16、。至少设两个剂量组(见5.6.1)，剂量应具有一定梯度，每组染毒一个剂量，若采用未成熟动物则其染毒期限为连续染毒3出若采用切除卵巢的成年动物则其染毒期限为至少连续染毒3d。于末次染毒后约24h对动物进行大体解剖。对于雌激素激动剂，应评价染毒组的平均子宫质量与对照组相比是否有统计学意义的明显增高。如果染毒组动物的平均子宫质量明显增高，则说明该试验结果为阳性。4 试验方法描述4. 1 动物种属的选择4. 1. 1 应使用常用的啃齿类动物品系，如本试验在验证时采用了SD大鼠和Wistar大鼠两个品系。如果已知或怀疑某种品系动物子宫的反应性差，则不应使用这种品系的动物。实验室应说明所使用的动物品系的敏
17、感性(见5.1)。4. 1.2 子宫增重试验中一直常规使用大鼠和小鼠。OECD对本试验进行验证时仅使用了大鼠，这是因为OECD认为使用大鼠和小鼠可能不会有什么不同，为了节省资源和动物，国际范围内的验证试验使用一种品系的动物就足够了。大鼠是多数生殖和发育毒性试验的首选动物种属。考虑到小鼠有大量既往资料、扩大本试验中啃齿类动物的使用范围而使用小鼠，因此，随后用小鼠开展了一些验证试验问。为了与起初设定的节省资源和动物的目的相一致，验证试验采用了如下简化的办法:缩小了参与验证的化学物和实验室的数量、未使用编码样品进行实验。用这种简化方法进行的卵巢切除的初成年小鼠验证试验的结果，从定性和定量两方面说明了
18、大鼠和小鼠的验证试验结果对应性很好。如果子宫增重试验是作为一个长期试验的预实验，则长期试验可选择使用与预实验相同的动物品系和动物来源。上述简化的方法仅限于切除卵巢的成年小鼠，未提供关于未成熟小鼠验证试验结果的资料，因此，GB/T 28647-2012 在本标准的范围内不考虑使用未成熟小鼠进行试验。4. 1.3 在有些情况下有可能使用小鼠而不使用大鼠。应依据毒理学、药代动力学和/或其他方面的资料说明使用小鼠的理由。使用小鼠时，也许需要对试验方法进行修改，例如由于小鼠单位体重的摄食量比大鼠多，因此小鼠饲料中植物雌激素的含量应比大鼠的低9.20.22J。4.2 饲养条件4.2. 1 有关动物饲养的所
19、有操作均应符合实验室所在地动物管理标准的要求。下面所述对动物管理和处理的要求仅是最低标准，如果当地有相关要求，也许应按照当地的动物管理要求。动物房温度应为22 c土3C，相对湿度最低为30%，最好不超过70%(清洁动物房时除外)。相对湿度的控制目标为在50%60%。采用人工照明，每日光照周期为明/暗各12h。4.2.2 动物应可自由摄食和饮水。初成年动物可单笼饲养或最多每笼3只群养。未发育成熟动物的年龄小，建议采用群养。4.2.3 已知饲料中高水平的植物雌激素能使啃齿类动物子宫质量增加到足以干扰子宫增重试验的结果13-1月。如果使用未发育成熟的动物，饲料中高水平的植物雌激素和代谢产生的能量可使
20、动物早熟。饲料中的植物雌激素主要来源于饲料中的大豆和首宿成分，而且不同批次的饲料中植物雌激素的浓度也不同叫。体重是一个重要的变量，因为摄食量与体重有关。因此，不同种属、不同年龄的动物从相同的饲料中所摄取的植物雌激素的剂量就可能不同凶。对于未发育成熟的雌性大鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的2倍。对于初成年的小鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的4倍。4.2.4 子宫增重试验的结果显示，饲料中含有一定水平的植物雌激素是可接受的，不会降低该试验的敏感性9.17-19J。对于未发育成熟的SD和Wistar大鼠，可参考每克饲料中植物雌激素的水平应不超过350问染料木黄
21、酣当量(genisteinequivalents)6.9J。这一参考同样适用于初成年切除卵巢的大鼠，因为其单位体重摄食量比未发育成熟的动物少。如果使用成年的切除卵巢的小鼠或使用对植物雌激素相对敏感的大鼠时，应按比例降低饲料中植物雌激素水平时。另外，不同饲料经代谢所产生能量多少的差异可导致青春期开始时间的改变川2J。4.2.5 试验前，应对饲料进行仔细选择以免由于饲料中植物雌激素水平高臼6叫.9J叼或代谢产生的能量高而影响试验结果【1川7川.1川确保与良好实验室规范(Goodlaboratory p严ra臼ct旧i比ce，GLP白)要求相一致，应对试验中的每批饲料进行代表性抽样以便必要时分析其中
22、植物雌激素的含量(例如当对照组子宫质量比历史对照值高时或对参比雌激素17a-乙快基雌二醇产生了不适当的反应时)。抽取的样品应进行分析，或将其-20.C冷冻保存，或采取某种可防止样品在分析前分解的方式保存。4.2.6 某些垫料中可能含有天然雌激素或抗雌激素物质(如已知玉米芯做成的垫料可影响大鼠的性周期，表现为抗雌激素样作用)。选择的垫料中植物雌激素的水平应尽可能的低。4.3 动物的准备将没有任何疾病和身体异常的动物随机分配到对照组和染毒组。应使由于笼具摆放位置而可能对动物产生影响最小化。动物应有唯一编号。对于未发育成熟动物，其在试验前观察期最好与母鼠或代哺母鼠同笼饲养至断奶。对于初成年动物以及与
23、母鼠或代哺母鼠同笼饲养的未发育成熟动物，试验前观察期大约为5d，对于已经断奶元母鼠跟随的未发育成熟动物，也许有必要缩短试验前观察期，因为染毒应在断奶后马上开始(见5.3)。3 GB/T 28647-2012 5 试验步骤5. 1 实验室能力验证5. 1. 1 可选择如下两种方式验证实验室的能力:一一定期验证，这有赖于最初基准阳性对照试验(5.1. 2)的情况。至少每6个月一次，而且每次应有一个可能影响试验结果的改变(如饲料配方改变、进行子宫解剖的人员发生改变，动物品系或供应商发生改变等);通过使用适当剂量(依据5.1. 2)的参比雌激素:17-乙快基雌二醇(17-ethinyl estradi
24、ol, EE) (CAS: 57-63-6)来验证试验系统(动物模型)的反应性。一一一每个试验应同时设一个用合适剂量的参比雌激素染毒的对照组。如果上述试验未得到预期结果，则应对试验条件做相应检查和修改。建议上述两种方式中使用的参比雌激素的剂量约为效应剂量的70%80%。5.1.2 基准阳性对照试验:在首次开展本试验前，实验室应通过测试动物模型的反应性来证明其能力，至少设立4个剂量组用于建立对参比雌激素:17-乙快基雌二障。7-ethinylestradiol,EE) (CAS No. 57-63-6)产生反应的剂量效应关系。子宫质量增加的情况与已有的历史资料进行比较问。如果该基准阳性对照试验未
25、产生预期结果，则应对试验条件进行检查和修改。5.2 动物的数量和条件各染毒组和对照组应至少包括6只动物(对未发育成熟动物和切除卵巢动物两个模型都适用)。5.3 未发青成熟的动物的年龄对于未发育成熟动物的子宫增重试验，应记录每只动物的出生日期。应尽早开始染毒以确保在染毒结束后与青春期有关的内源性雌激素水平还没有增高。另一方面，有证据表明年龄太小的动物可能敏感性较差。为了确定动物的最佳年龄，每个实验室应从其历史资料中了解有关动物成熟日期方面的资料。一般来说，大鼠的染毒可在出生后第18天早期断奶后立即开始。大鼠的染毒最好在出生后第21天完成，但最晚不可超过出生后的第25天，因为此后大鼠的下丘脑一垂体
26、一卵巢轴开始出现功能，内源性雌激素水平可能开始增高，同时子宫质量均值及其标准差也增加2-3，10-12J。5.4 卵巢切除术的程序5.4. 1 对于切除卵巢的雌性大鼠和小鼠(染毒组和对照组)，卵巢切除应在6周龄至8周龄进行。对于大鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔14d以便使子宫退缩到最小、最稳定。对于小鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔7d。由于少量的卵巢组织就足以引起明显的体内雌激素水平阳，因此，使用动物前应连续5d(例如卵巢切除后第10天至第14天)对动物进行阴道上皮涂片检查以检测动物的发情周期。如果证明某只动物进入了发情周期，则这只动物不能被用于试验。此外，解剖检查时，应注意检查是
27、否存在残留的卵巢，有残留卵巢组织的动物不应计算在结果中问。5.4.2 进行卵巢切除时，采用一种适当的麻醉方法将动物麻醉后置于腹卧位。在腹腔后外侧壁切口，切口应为长度约1crn的纵向切口，其中点为肋下缘和儒骨顶部之间的中间点，横向距腰肌外侧缘几毫米。将卵巢从腹腔移至元菌环境。将卵巢与输卵管和子宫体分离。确认元大量出血后缝合腹壁，皮肤用夹子关闭切口或用适当的缝合线缝合。切除点在图1中有图示。应使用有经验的啃齿类动物兽医推荐的方法对动物进行术后镇痛处理。4 、-切开不暴露腹膜、血管及脂肪层GB/T 28647-2012 说明2进行卵巢切除时，先在腹腔后外侧壁切口，其中点为肋下缘和路骨崎之间的中间点，
28、横向距腰肌外侧缘几毫米。在一个无菌的区域，将卵巢从腹腔移出来，在卵巢和子宫之间放一个绷带止血，于输卵管和每个子宫角的连接点处切掉卵巢。确定没有大的持续性出血后缝合腹壁，皮肤切口用夹子关闭或用适当的缝合线缝合。使用动物前至少应有14d的时间使动物恢复和使子宫质量减少。图1手术取出卵巢的过程示意图5.5 体重对于切除卵巢动物，体重和子宫质量并不相对应，这是因为子宫质量受激素(如雌激素)的影响，但不受调节身体大小的生长因子的影响。但是，对于未切除卵巢的断奶动物，在性成熟过程中其体重与子宫质量却是相关的问。因此，对于未发育成熟动物，试验开始时动物体重的差异应为最小或不超过平均体重的士20%。这就意味着
29、饲养者应使每窝留取相同数量的仔鼠以确保每窝仔鼠都可以得到基本相同的哺育。将动物随机分配到各组(对照组和染毒组)以便各组的平均体重元统计学显著性差异。在不增加试验用仔鼠总数的前提下，应尽量避免将同窝仔鼠分配到相同的染毒组。5.6 剂量5.6. 1 为了确定受试物是否具有体内雌激素作用，一般设两个剂量组和一个对照组就足够了。这种设计也最符合动物福利的要求。如果为了获得剂量-反应曲线或为了向更低剂量外推，则只是需要3个剂量组。如果需要获得雌激素作用之外的信息(如估计其作用的潜能)，则可能考虑另外的剂量设计。除了不染毒受试物外，对照组动物应与染毒组的处理相一致。染毒受试物时如果使用了某种溶剂，则对照组
30、应使用与染毒组相同量的溶剂(各染毒组使用榕剂量不同时，对照组按最高的溶剂量使用)。5.6.2 子宫增重试验的剂量设计是为了选择出连续3d染毒受试物后可确保动物存活且对动物不产生明显毒性或痛苦的剂量，最大剂量不超过1000 mg/Ckg d)。各剂量选择时应考虑受试物或其有关物质的已有的毒性及毒代动力学资料。最高剂量应首先参照受试物的LDso值和/或急性毒性资料以避免动物出现死亡、严重的疾病和痛苦表现川的。最高剂量可代表MTD;也可以为引起子宫增重反应阳性的剂量水平。作为筛选试验，采用大的剂量间隔(例如0.5个对数单位，对应的剂量间距为3.2;或更大，采用1个对数单位)一般是可以接受的。如果没有
31、合适的资料供参考，也许应通过开展预试验来确定剂量范围。5.6.3 另外，如果受试物体外试验(或结构-活性)可提供其雌激素样作用的资料，这些资料也可用于剂量设计。例如要了解受试物引起子宫增重在多大剂量相当于参比雌激素激动剂(乙快基雌二醇，ethinyl estradiol)引起该作用的剂量，可通过评价其在体外试验中相当于乙快基雌二醇作用的剂量来了解。可将对应的乙快基雌二醇剂量乘以一个因子，例如10或100，作为染毒的最高剂量。5 G/T 28647-2012 5. 7 确定剂量范围应考虑的问题必要时，可用少量动物开展预试验来寻找剂量范围。可根据OECD第19号指导性文件叫来判定动物是否出现了可预
32、示动物毒性和痛苦的临床表现。如果预试验确定的剂量范围是可行的，应在末次染毒后约24h分离子宫并称重。然后，这些资料可被用于在设计正式试验时作为参考(选择一个可接受的最大和较低剂量，并确定剂量组的个数)。5.8 染毒5.8.1 经灌胃或皮下注射方式染毒受试物。选择染毒途径时应从动物福利和毒理学方面进行考虑。毒理学方面需要考虑与人接触这种化学物途径的相关性(如人经口接触时则动物采用灌胃染毒，人经吸人或经皮肤接触时则动物采用皮下注射方式染毒)，受试物的物理/化学特性，特别是已有的毒理学信息和代谢动力学方面资料(如应避免受试物在首次吸收部位被代谢，使其经某一特定途径吸收时效率更高)。5.8.2 建议尽
33、可能首先考虑使用水溶液或水悬浮液。由于多数雌激素配体或其代谢前体往往不能溶于水，最常用的方法是使用油溶液或油悬浮液(如玉米油、花生油、芝麻油或橄榄油)。这些油含有一定的热量和脂肪含量，从而使动物摄入的可代谢能量的总量发生改变，并对试验的观察终点(如子宫的质量)产生潜在影响叫。因而，在试验前应开展试验来说明溶剂对照组与不使用溶剂的对照组的结果有元区别。可将受试物溶解于尽可能小量的95%乙醇或其他适当溶剂中，用溶剂稀释到最终工作浓度。应了解榕剂的毒性特征并在试验时设立溶剂对照组。如果受试物是稳定的，则可采用轻微加热和强烈的机械动作来促进其溶解。应测定受试物在溶剂中的稳定性。如果在试验期间受试物稳定
34、，可先配制受试物的储备液，每天现配制指定剂量的稀释液。5.8.3 染毒时间依赖于使用的动物模型(未发育成熟动物模型参见5.3，卵巢切除动物模型参见5.4)。未发育成熟雄性大鼠每天染毒一次受试物，连续3d。切除卵巢的雌性大鼠也同样推荐采用3d染毒，但是增加染毒天数也是可以接受的，而且可有助于弱雌激素活性受试物的检测。对于切除卵巢的雌性小鼠，3d的染毒应就足够了，对于强雌激素样受试物，染毒延长至7d没有很大意义，然而，对于弱雌激素样受试物染毒是否需要延长至7d在方法验证时16J没有被证明，因而，对于切除卵巢的小鼠可连续染毒7d。应在每天基本相同的时间染毒，应根据动物体重调整染毒量例如mg/(同.d
35、) 。应通过调整染毒溶液的浓度使单位体重的染毒体积基本不变，元论采取何种染毒途径，这样可保证各剂量组单位体重的染毒体积固定不变。5.8.4 采用灌胃方式染毒时，每天用胃管或适当的插管对动物进行一次染毒。每次染毒的受试物溶液的最大容积应依据实验动物的大小而定。应遵循当地动物管理的要求，但最大容积应不超过5mL/峙，水溶液则最大容积可为10mL/kg。5.8.5 经皮下注射染毒受试物时，应每日染毒一次。应在背侧肩肝区或腰区通过消毒的针头如23号或25号(OECDTG 440中要求的规格)J和结核菌素注射器注射受试物。注射部位是否去毛可自行选择。应记录在注射部位任何注射量的损失、漏出或注射不完全。每
36、只大鼠每天注射的总量应不超过5 mL/kg，并分别在2个部位注射，水溶液注射总量可为10mL/kgo 5.9 观察5.9. 1 一般观察和临床观察一般的临床观察应至少每天一次，观察到毒性表现后应增加每天的观察次数。最好在每天固定时间进行观察、并考虑到染毒后预期的效应峰值时间。观察所有动物的死亡率、发病率和一般的临床表现，如行为、皮肤、毛发、眼睛、蒙古膜、分泌物和排泄物及自主行为(例如流泪、毛发竖立、瞠孔大小改变、异6 常呼吸模式)等方面的改变。5.9.2 体重和饲料消耗GB/T 28647-2012 从染毒开始前，即动物被随机分组后开始，应对所有动物每天称量一次体重，精确到0.1g。可以测定也
37、可以不测定染毒期间饲料的消耗量，测量时可由动物饲养员对期间每笼动物的饲料消耗量进行测量。饲料消耗量应表示为克/每只大鼠/天。5.9.3 子宫解剖和称重5.9.3. 1 于末次染毒后24h安乐死大鼠。理想的情况是随机安排各组动物的解剖顺序，以避免由高剂量组到低剂量组或由低剂量组到高剂量组进行解剖而产生的细微影响。本试验是要测量子宫的湿重和去除子宫腔内液体后的子宫质量。子宫湿重包括子宫及子宫腔内液体的质量。去除子宫腔内液体后的子宫质量是在去除子宫腔内成分后进行测量。5.9.3.2 未发育成熟的动物在分离子宫前应检查阴道的开口情况。解剖过程首先从耻骨联合开始打开腹壁。看到喇叭状子宫和卵巢后将其从腹后
38、壁分离。从子宫和阴道的腹面和外侧面去除膀脏和输尿管。分离直肠和阴道之间的纤维粘连直至能够看到阴道口和会阴皮肤的连接处。通过切开会阴皮肤汇合处上方的阴道壁将子宫和阴道从身体分离，见图2。小心地剪断每个与喇叭状子宫连接的所有肠系膜而将子宫与身体后壁分离。子宫一旦从身体分离后，应尽快予以处理以免组织干燥。对于子宫这样的小组织，由干燥而导致质量损失是很明显的间。应在输卵管处分离卵巢以免子宫腔内液体流出。对于切除卵巢的动物，应检查是否有残存的卵巢组织。应去除多余的脂肪组织和结缔组织。在子宫颈稍下方分离阴道，这样子宫颈可与子宫体在一起，见图2。说明z首先，从耻骨联合处切开腹壁，然后将卵巢和子宫从腹后壁分离
39、。将位于子宫和阴道腹面和侧面的膀脱和输尿管去除。分离直肠和阴道之间的纤维组织直至可看到阴道口与会阴部皮肤的连接点。通过切开阴道与会阴部皮肤连接点上方的阴道壁分离出子宫和阴道。小心剪开腹腔后侧和外侧所有与子宫连接的肠系膜将子宫分离。去除子宫多余的脂肪组织和结缔组织。在输卵管处切掉卵巢并避免子宫腔内液体从子宫角流出。对于己切除卵巢的动物，应检查是否有残留的卵巢组织。在紧挨子宫颈的下面将阴道与子宫分离，这样，子宫颈仍然与子宫在一起。然后，称量子宫的质量。图2测定子宫质量时组织的切除和准备示意图5.9.3.3 将每个子宫放置于有唯一编号且称过重的容器内(如皮氏培养皿或塑料称量瓶)，继续小心保管以避免称
40、重前组织干燥(如将稍微沽湿了生理盐水的滤纸放在容器中。称量含子宫腔内容物的子宫(子宫湿重)时应精确到0.1mg。5.9.3.4 然后去除每个子宫腔内的液体。将两个子宫刺破或纵向切开。将子宫放在稍微潮湿的滤纸上(如沃特曼3号，whatmanNo. 3) ，用另一块稍微潮湿的滤纸轻轻挤压以完全去除子宫腔内的液体。称量去除子宫腔内液体后的子宫质量时应精确到0.1mgo 7 GB/T 28647-2012 5.9.3.5 试验结束时，子宫的质量可被用于证明所使用的未发育成熟模型大鼠的年龄未超过试验要求的适当年龄，这需要参考试验所选用的某种品系大鼠的历史资料(见7.3)。5.9.4 其他检测可自行选择以
41、下检测:称重后，将子宫固定在10%中性福尔马林缓冲液中，苏木素-伊红染色后进行组织病理学检查。阴道也可做组织病理学检查(见引言的第9段)。另外，可对子宫内膜上皮进行形态测量以便定量比较。6 试验数据和报告6. 1 数据试验数据应包括:一一试验开始时的动物数;一一试验期间死亡或被安乐死的动物数量和编号、动物死亡或被安乐死的日期和时间;一一毒性表现的动物数量和编号，观察到的毒性表现进行描述，包括其出现时间、持续时间和严重程度;一一出现任何损伤的动物数量和编号，对损伤类型进行描述。6.2 数据分析每只动物应记录如下资料z体重、子宫湿重和去除子宫腔内液体后子宫的质量。分析染毒受试物是否引起子宫增重有统
42、计学显著性改变时，应采用单侧统计学分析(p0.05)。应采用适当的统计学分析方法来检验子宫质量增加是否有统计学意义。例如可采用协方差分析方法(ANCOVA)对数据进行统计分析，以解剖时动物的体重作为协变量。子宫质量的数据在分析前可先进行方差稳定性对数转换。达尼特(Dunnett)和苏(Hsu)的检验适合对每个剂量组与溶剂对照组之间做两两比较，并计算置信区间。可应用学生分布残差图(studentisedresidual plot)来发现偏离大的值和进行方差一致性检验。OECD在进行方法验证时，应用广义线性模型类(PROCGLM)统计学分析系统(SAS协会，Cary，NC)的第8版软件6-7J进行
43、分析时，采用了上述统计学方法。6. 3 最终报告最终的报告应包括如下内容:6.3. 1 试验机构一一参与试验的人员及其职责;一一基准阳性对照试验的数据和定期阳性对照组的数据(见5.1.1和5.1. 2)。6.3.2 受试物8 一一受试物的描述;物理性状及相关的物理化学性质;一一稀释液的配制方法和配制次数;一一关于稳定性的任何资料;一一任何对制备的受试物溶液所做的分析。GB/T 28647-2012 6.3.3 溶剂一一溶剂描述(性质、供应商、批号); 一一溶剂选择的理由(除水之外)。6.3.4 实验动物一一-选择种属和品系的选择理由;一一供应商及其能力;一一购买时的日龄;一-对于未发育成熟的动
44、物是否提供了母鼠或代哺母鼠，说明断奶日期;一-动物试验前观察期的详细资料;一一每笼动物数E一一每只和每笼动物编号的详细情况及编号方法。6.3.5 试验条件一一随机分组过程的详细资料(即随机分组所用的方法); 一-剂量选择的合理性;一一受试物组分的详细说明，所配制受试物溶液的浓度、稳定性和均匀性的资料;受试物染毒的详细情况，所选染毒途径的合理性;一一饲料(名称、类型、供应者、组成成分、植物雌激素水平(若己知); 一饮用水的来源(如自来水还是滤过水)和供给(从大容器通过管道供给还是经水瓶供给); 一-垫料(名称、类型、供应者、组成成分); 一-记录笼具情况、照明间隔、室内温度和湿度、房间清洁等情况
45、;二一详细描述解剖和子宫称重过程;一描述统计方法。6.3.6 结果6.3.6.1 单个动物一一每天每只动物的体重(从随机分组一直到解剖)(精确到0.1g); 一一一染毒开始时每只动物的日龄(计算日龄时出生日为第0天); 每次染毒的日期和时间;一一计算的染毒容积和染毒剂量，应记录染毒时和染毒后染毒剂量的损失情况;一一每日记录动物状态，包括相应的症状和观察结果;一-死亡的可能原因(包括试验过程中颜死动物及死亡动物); -一动物安乐死的日期和时间及其与末次染毒间隔的时间;一-子宫湿重(精确到0.1mg)及在分离子宫时引起子宫腔内液体流出的情况记录;二去除子宫腔内液体后子宫的质量(精确到0.1mg)。
46、6.3.6.2 每组动物一一动物每日(从动物分组直至解剖时的体重均值(精确到0.1g)及其标准差;一-一子宫湿重和去除子宫腔内液体后子宫的质量(精确到0.1mg)的均值和标准差;一-如果测量了饲料消耗量，应计算每日的饲料消起量(表示为每只动物消耗饲料的克数); 9 GB/T 28647-2012 一一染毒组与溶剂对照组的子宫湿重和去除子宫腔内液体后子宫的质量相比较的统计学分析的结果;一一染毒组与溶剂对照组的体重和体重增加值相比较的统计学分析的结果。6.3.7 试验方法要点汇总(见表1)表1试验方法要点汇总动物大鼠小鼠品系常用的自齿齿类实验动物品系动物数量每剂量组至少6只动物组数最少2个染毒组见
47、5.6.1)和1个阴性对照组;阳性对照组见5.1.1和5.1.2饲养条件动物房温度22 c士3C相对湿度50%-60% ，不低于30%、不超过70%每日光照顺序明/暗各12h 饲料和饮水自由摄食和饮水饲养单笼饲养或每笼不超过3只群养(未发育成熟的动物推荐群养)饲料和垫料建议饲料和垫料中植物雌激素的水平要低试验操作要求方法未发育成熟动物不切除卵巢的方法(首选); 切除卵巢的成年雌性动物方法切除卵巢的成年雌性动物方法未发育成熟动物开始染毒时的最早在出生后第18天，应在出生后第25天在本标准范围内未涉及日龄前完成染毒卵巢切除时动物的年龄6周龄至8周龄之间切除卵巢动物开始染毒时的年龄自卵巢切除至首次染
48、毒至少应间隔14d 自卵巢切除至首次染毒至少应间|隔7d 体重体重变异应最小，不超过平均体重的士20%染毒染毒途径经口灌胃或经皮下注射染毒次数每天染毒一次经口灌胃或经皮下注射染毒时:;5 mL/kg(水溶液则可不大于10mL/kg) (经皮下注射染毒时应经2个部位的染毒体积注射)染毒持续时间采用未发育成熟动物时连续染毒3d; 采用切除卵巢动物时连续染毒7d 采用切除卵巢动物时连续染毒至少3d 解剖时间末次染毒后约24h 结果阳性反应子宫质量均值的增加有统计学显著性(湿重和/或去除子宫腔内液体后子宫的质量)参比雌激素17a-乙快基雌二晖10 GB/T 28647-2012 7 结果的解释和认可7
49、. 1 如果染毒组(至少是高剂量组)的子宫质量与榕剂对照组相比有统计学显著性增加(0.0日，则可认为雌激素试验结果为阳性。若存在生物学上可接受的剂量-反应关系则可进一步支持阳性结果，注意受试物产生的雌激素样作用和抗雌激素样作用相叠加可影响剂量-反应关系曲线的形状。7.2 染毒剂量应不超过最大耐受剂量。解释数据时应全面评价体重降低、毒性表现和其他试验结果。7.3 子宫增重试验的结果是否被认可的一个重要考虑因素是溶剂对照组的子宫质量。对照组子宫质量大可降低该试验的反应性和检测雌激素样作用非常弱的受试物的能力。文献资料和该试验验证试验的数据提示，对照组子宫质量大的情况确实存在，尤其是未发育成熟的动物川叫。因为未发育成熟大鼠的子宫质量依赖于很多变量如品系或体重，不能给出一个确定的子宫质量的上限值。如果未发育成熟对照组大鼠的去除子宫腔内液体后子宫的质量为40mg45 mg.则可认为结果是可疑的，若该质量超过45mg可能需要重新进行该
