1、ICS 65020B 61中华人民 共禾口y国林业行业标准LYT 1 772-2008杨树品种分子鉴定实验方法DNA扩增片段长度多态性法(AFLP)Molecular identification method for varieties of poplarAmplified fragment length polymorphism(AFLP)2008-09-03发布 200812-01实施国家林业局 发布前 言LYT 1772-2008本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家林业局提出。本标准由全国林木种子标准化技术委员会归口。本标准起草单位；中国林业科学研究院林业研究所、中国科学院遗传与发
2、育生物学研究所和国家林业局北方林木种子检验中心。本标准主要起草人：李金花、张绮纹、王斌、宋红竹、周春江、卢孟柱、李庆梅、牛正田。杨树品种分子鉴定实验方法DNA扩增片段长度多态性法(AFLP)LYT 1772-20081范围本标准规定了以杨树新鲜组织(叶片、芽等)为材料，利用扩增片段长度多态性DNA法(AmplifiedFragment Length Polymorphism，简称AFLP)对杨树品种进行分子鉴定的实验方法。本标准适用于杨树品种的分子鉴定。2原理杨树基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机片段，将针对EcoRI和Mse I的特定接头连接在这些DNA片段的两端，
3、形成带特异接头的DNA片段，随后利用一对与接头和邻接酶切位点相匹配的引物进行扩增，最终通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异性片段分离开来，通过比较待测品种和对照品种间DNA指纹谱带数据的差异，来判定待测品种与对照品种是否为相同品种。3仪器和设备31通用实验室仪器设备。32梯度PCR扩增仪。33琼脂糖胶电泳系统。34变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。35紫外透射仪。36凝胶成像系统或照相系统。37重蒸馏水仪。4试剂与溶液除非另有说明，在分析中使用分析纯试剂。配制好的溶液经高压灭菌后使用。实验中所使用的水均为无菌超纯水。41 DNA限制性内切酶EeoRI和MseI(10 U-lL)及其10反应缓冲液一2
4、0保存。42 Taq DNA聚合酶(1 UpL)及其10PCR反应缓冲液10PCR反应缓冲液含200 mmolL TrisHCI(pH84)、15 mmolL氯化镁(MgClz)和500 mmolL氯化钾(KCl)，一20保存。43 I4 DNA连接酶(1 UpL)殛其10连接反应缓冲液10反应缓冲液含350 mmolL TrisHCl(pH76)、50 mmolL MgCl2和500 mmolL KCl和5 mmolL p巯基乙醇；-20保存。44 四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液(各10 mmolL)一20保存。45 DNA分子量标记(DNA Molec
5、ular Weight Marker)A DNA和DNA Marker DL 2000，一20保存。1LYT 1772-200846 1 molL Tri#-HCI(pH80)称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH(25下)至80，用水定容至1 L，100 mL分装，高压灭菌，室温保存。47 500 retoolL EDTA(乙=胺四乙酸)溶液(pH80)将1861 g乙二胺四乙酸二钠(Na：EDTA2H。0)溶于800 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅动，先用氢氧化钠(NaOH)颗粒(约20 g)调pH接近80，再用10 molL NaOH溶液调pH至
6、80，用水定容至1 L，分装后高压灭菌，室温保存。48 05 mpJmL澳化乙锭(EB)溶液称取100 mg EB，用200 mL水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温储存，工作浓度为05 mgL，每毫升电泳缓冲液中加1 pL EB。49 10 molL氢氧化钠(NaOH)溶液称取80 g NaOH，先用160 mL水溶解后，再加水定容至200 mL，高压灭菌，室温保存。410 5 molL氯化钠(NacI)溶液溶解292 g NaCI于足量的水中，定容至i00 mL，高压灭菌，室温保存。411 CTAB提取缓冲液CTAB提取缓冲液的成分为2(质量浓度)溴代十六烷基三甲胺(cTAB)、100 mm
7、olL TrisHCI、20 mmolL EDTA(pH8o)、14 molL NaCl、05(质量浓度)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和02(质量浓度)p巯基乙醇(用前加入)。在800mL去离子水中，加入4675 gNaCl、2 gCTAB、05 gPvP，搅动溶解后，加入10 mL 1 mmolL Tris_Hcl(pH8o)、500 mmolL EDTA(pH8o)4 mL、36 mL水和2 mL卢巯基乙醇(用前加人)。412 3 molL乙酸钠(NaAc3H20)(pH52)取408 gNaAc3H。O溶于约90mL水中，用冰乙酸(CH3COOH)调溶液的pH至52，再加水定容到100 m
8、L，高压灭菌后室温保存。413 5 molL乙酸钾(KAc)取491 g KAc溶解于足量的水中，加水定容到100 mL，室温保存。414 24：1(体积比)三氯甲烷-异戊醇将96 mL三氯甲烷和4 mL异戊醇混匀后，室温保存。415 70(体积分数)乙醇70 mL无水乙醇加入30 mL水，室温保存。416 TE缓冲液(pH80)取1 mmolL Tris-HCl(pH8O)1 mL，500 mmolL EDTA(pH80)02 mL，用水定容至100 mL，高压灭菌，室温保存。4仃10mgmL胰RNA酶(RNaseA)称取1mgRNaseA，溶于100 pLTE缓冲液中，水浴(100)10r
9、ain，缓慢冷却至室温，10 pL分装，-20保存。4侣TAE电泳缓冲液(50x)称取242 g Tris碱，加入571 rrlL的冰乙酸(174 toolL)、200 mL的500 mmolL EDTA溶液(pH8o)，用水定容至1 L，100 mL分装，高压灭菌，4保存。419 TBE电泳缓冲液(10x)称取108 gTris碱和55 g硼酸，溶于适量水中，加入40mL 500mmolLEDTA溶液(pH8o)，用水定容至1 L，100 mL分装，高压灭菌，4保存。420 08琼脂糖凝胶的配制称取08 g电泳级琼脂糖置于200mL三角瓶中，加入100mLlTAE(或TBE)电泳缓冲液中，在
10、2LYT 1772-2008微波炉中熔化至溶液透明(确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化)，冷却至5060，加入EB(10 mgmL)溶液使其终浓度为05 vgmL(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用05-gmL的EB溶液室温下浸泡染色20 min25 rain)，混匀后倒人放好梳子(距底板约1 ram)的载胶板上，凝胶厚度为3 mm5 Infix，待凝胶完全凝固后拔出梳子放人电泳槽中，然后向槽内加人1TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。421琼脂糖凝胶加样缓冲液(6x)称取溴酚蓝250 mg，加水10 mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝250 mg，用10 mL水溶解；称取蔗糖50
11、 g，用30 mL水溶解；混合三种溶液，用水定容至100 mL，在4保存。422 2的别离硅胶在500 mL瓶装三氯甲烷内加入10 mL剥离硅烷。423 05的亲合硅胶2 pL亲合硅烷与2 mL 95乙醇混合，现用现配。424 6丙烯酰胺胶贮存液(6PA)将42042 g尿素、57 g丙烯酰胺、3 g甲叉一双丙烯酰胺和100 mL 10TBE混匀后，用超纯水溶解定容至l L，抽气过滤在不透光的瓶子里，4保存。425甲酰胺染料(98甲酰胺，10mmolLEDTA，003澳酚蓝和003二甲基苯腑蓝)49 mL 98甲酰胺，1 mL 500 mmolL EDTA(pH8o)，0125 g溴酚蓝和01
12、25 g二甲基苯腈蓝，混匀后室温保存。426 10过硫酸铵称取2 g过硫酸铵，溶于18 mL水中，500 pL分装，-20保存。427染色液(使用前10 min配制)称取2 g硝酸银(AgN08)和3 mL 37甲醛，用水定容至2 L，混匀后使用。428显影液(使用前5 h配制)称取60 g碳酸钠(NazCO。)，加适量水溶解后定容至2 L，冷却至4。使用前5 rain加入3 mL37甲醛、400 pL 10 mgmL硫代硫酸钠。429 geoRIMseI接头溶液4291EeoR I接头序列Adapter I(Eadl)：5 L CTCGTAGACTGCGTACC一3Adapter II(Ea
13、d2)：5一AATTGGTACGCAGTC一3EcoR I接头溶液中Eadl和Ead2的浓度均为5 pmolL，一20保存。4292 Mse I接头序列Adapter I(Madl)：5一GACGATGAGTCCTGAG一3Adapter II(Mad2)：5一TACTCAGGACTCAT一3MI接头溶液中Madl和Mad2的浓度均为50 pmol_iL，-20保存。430引物4301预扩增引物序列EcoR I+0(E-O)：5一GACTGCGTACCAATTC一3EcoR I+A(EA)：5一GACTGCGTACCAATTCA一3Ms*I+C(MC)：5L GATGAGTCCTGAGTAAC
14、一34302选择性扩增引物序列EAT(EcoR I+AT)：5一GACTGCGTACCAATTCAT一3EAG(EcoR I+TA)：5一GACTGCGTACCAATTCAG一3E-AC(EcoR I+AC)：5一GACTGCGTACCAATTCAC一33LYT 1772-2008E-TA(ECOR I+TA)：5_GACTGCGTACCAATTCTA一3 7E-TC(EcoR I+TC)：5一GACTGCGTACCAATTCTC一3E-TG(EcoR I+TG)：5一GACTGCGTACCAATTCTG一3MCAC(Mse I+CAC)：5_GATGAGTCCTGAGTAACAC一3MCAG
15、(Mse I+CAG)：5一GATGAGTCCTGAGTAACAG一3MCTA(Mse I+CTA)：5一GATGAGTCCTGAGTAACTA一3MCTC(Mse I+CTC)：5-GATGAGTCCTGAGTAACTC一3MCTT(Mse I+CTT)：5-GATGAGTCCTGAGTAACrT一3引物溶液用TE缓冲液(pH8o)稀释至浓度为25 ngpL，-20保存。5实验方法51取样选用杨树新鲜叶片或其他器官和组织提取DNA。本实验方法选用的我国北方地区10个杨树品种参见附录A的表A1。52 DNA的提取、纯化及定521 CrAB法提取DNA取杨树新鲜叶片或处理过的芽4 g5 g，在液
16、氮中迅速研磨成粉末状，转至50 mL离心管中，加入10 mL 65水浴预热的cTAB提取液(100 mmolL TrisHCl，20 mmolL EDTA，14 molL NaCl，2CTAB，用前加人02卢巯基乙醇)，充分混匀后放人65水浴中保温30 rain，其间温和混匀2次3次；取出离心管待冷却至室温后，加入5 mL 5 mmolL KAc，混匀，冰浴放置10 rain，加入10 mLZ氯甲烷一异戊醇(体积比24 t 1)，轻缓颠倒混匀溶液。在4下8 000 rrain离心10 rain。移取上清液至另一已加入15 mL异丙醇的50 mL离心管中，4放置，待絮状DNA沉淀漂至液面时，用钩
17、状玻璃棒捞出DNA絮团，置于15mL离心管中。用70乙醇浸泡洗涤沉淀，风于后加人600 pLTE缓冲液溶解沉淀。522 DNA的纯化加2 pL RNase A(10 mgmL)，37保温2 h，加人600 pL的三氯甲烷一异戊醇(体积比24：1)，轻缓颠倒混匀，8 000 rrain离心10 rain，仔细吸取上清液至新的15 mL离心管中，加入等体积的三氯甲烷，8 000 rrain离心10 rain，吸取上清液至新的15 mL离心管中，加入110(体积比)的3 molLNaAc溶液(pH52)和2倍体积的冷无水乙醇，混匀，4放置，待DNA形成絮状沉淀后，用玻璃棒捞出沉淀移至新的15mL离心
18、管中，用70乙醇洗涤沉淀，风干后加适量TE缓冲液溶解沉淀，一20保存。523 DNA定量用TE缓冲液配制0 pgmL、l pgmL、25 pgmL、5 fgmL、75 agmL和10 PgmL的2-DNA分子量标准，各取2 pL-DNA分子量标准溶液和2 PL未知浓度的DNA样品，在08琼脂糖凝胶上电泳，稳压80 V，电泳缓冲液为1TBE，325 Rill紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。根据测定结果，将样品DNA的浓度稀释至大约200 ngPL，一20保存。植物总DNA样品应呈现一条相对分子质量较大的整齐清晰的条带，参见附录A的图A1。53 AFLP实验流
19、程531模板DNA的酶切用限制性内切酶EcoRI和MseI对DNA样品进行双酶切。在200 pL的离心管中依次加入10酶切反应缓冲液2 pL、模板DNA 4 pL、踟R I和Mse I酶(10 upL)各03 pL，用无菌超纯水补足至反应体系总体积为20 pL，混匀后在37下进行酶切反应，2 h后将酶切产物在70下加热15 rain，终止酶切反应，然后置于冰上。取4 pL酶切产物于10N琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA是否被完全酶4LYX 1772-2008切。DNA经完全酶切后，在500 bp附近形成均匀的弥散带，且点样孔周围没有杂质。532 DNA片段接头的连接在531酶切反应后的125 pL
20、反应体系中依次加入10连接反应缓冲液4 PL、EcoR I和Mse I接头溶液各1 pL、T。DNA连接酶(1 UpL)I pL，用无菌超纯水补足至反应体系总体积为40 pL，混匀后在20保温4 h，然后稀释10倍后用作预扩增反应的模板，参见附录A的图A2。533 DNA酶切连接片段的预扩增反应取532连接反应产物稀释10倍后，在200 pL的离心管中依次加人10PCR缓冲液1止、dNTP(1 mmolL)l pL、预扩增引物各1 PL、稀释后的酶切连接产物2 pL、Taq DNA聚合酶(5 UpL)02吐，用无菌超纯水补足至PCR反应体系总体积为10止，以4 000 rrain离心10 s后
21、，将PCR管插入PCR仪中，进行20个扩增反应循环(90变性30 s、56复性60 s、72延伸60 s)，取出PCR反应管，置于4保存。取上述预扩增反应产物6 btL8 pL，在1o琼脂糖凝胶上电泳，检测预扩增反应的效果。经过酶切连接和预扩增反应后，较好的连接和预扩增产物在500 bp附近形成弥散带，在弥散带中看到深浅不一的条带，参见附录A的图A3。根据预扩增产物浓度进行稀释，一般预扩增产物稀释10倍30倍，用作选择性扩增反应的模板。534选择性扩增反应在200 pL离心管中依次加入10PCR缓冲液10 PL、dNTP(1 retoolL)1 btL、选择性扩增引物E-XX 025 pL和M
22、CXX 225 pL、模板25 pL、Taq DNA聚合酶(5 UpL)02 pL，用无菌超纯水补足至PCR反应体系总体积为10 pL，以4 000 rrain离心10 s后，将PCR管插入PCR中，1次扩增反应循环(9030 s，6530 s，7260 s)，递降温度梯度的12个循环(复性温度逐级降低07，变性和延伸条件同上)，最后是23个循环(9030 s，5630 s，7260 s)。PCR反应结束后，在每个反应管中加入等体积(10 m。)甲酰胺染料(98去离子甲酰胺，10 mmolLEDTA，003漠酚蓝和003二甲基苯腈蓝)，充分混匀后于90变性3 rain，并迅速置于冰上。535聚
23、丙烯酰胺凝胶的制备5351玻璃板的清洗玻璃板水洗干净后，再用酒精擦洗并晾干，一块玻璃板上涂上2剥离硅胶后，再用酒精冲洗并晾干，另一块玻璃板上涂上05的结合硅胶。待两块玻璃板彻底干燥后，才能进行玻璃板组装和灌胶。5352电泳槽的组装、水平仪检测5353丙摇酰胺胶的配制在100 mL 6 0A PA胶中加入500 pL 10过硫酸铵和100 mL四甲基乙二胺(TEMED)，迅速轻轻混匀。5354灌胶把胶沿灌胶口轻轻灌进刚配制的胶，避免出现气泡，待胶流动到玻璃板底部，在灌胶口轻轻插入梳子，待胶凝固1 h以上，进行预电泳。536上样和电泳在200 mL 10TBE缓冲液中加入1 800 mL水，混匀后
24、将800 mL加入正极槽中，l 200 mL预热至60，加入负极槽中。先将胶进行预电泳20 min30 rain，使凝胶温度达到4550。取4 pL变性后的选择性扩增反应样品上样，电泳在100W恒功率下进行，电泳时间约为25 h3 h，待第一条染色带至胶版的另一前沿时，结束电泳，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴于涂布亲合硅烷的平板玻璃板上。537银染将带凝胶的平板玻璃放人15 L新配制的10冰乙酸(固定终止液)中，摇床(70 rrain)摇动20 min30 rain，直至二甲基苯腈蓝的颜色褪去；用重蒸水冲洗2次，每次5 rain；加染色液，摇床5LYT 1772-2008(70 rrain)上
25、轻轻摇动30 min，重蒸水冲洗1次，15 s加入4预冷的显影液，摇床上轻摇至清楚条带显现；用水冲洗后，迅速放人10冰乙酸中，轻摇3 rain 5 rain进行固定，用重蒸水冲洗2次，每次2 rain，取出胶板，用凝胶成像系统扫描照相，或将玻璃板置于室温下，自然干燥。538谱带记录选取电泳图上清晰、易于辨认的多态性条带进行记录和统计，根据DNA分子量标准计算出各扩增条带相应的DNA片段分子量大小(近似值)，以选择性引物组合的名称加上DNA片段分子量大小为后缀对条带进行命名，并分别用“1”和“0”代表“有”带和“无”带，获得DNA指纹图谱数据，参见附录A表A2。也可利用计算机模拟出分析图谱，参见
26、附录A图A4。6分析和鉴定先用1对选择性引物组合检测，对获得的待测品种和对照品种问DNA指纹谱带数据进行比较，两个品种间差异谱带数量2条以上时，判定待测品种与对照品种为不同品种；当两个品种间谱带无差异时，继续用其选择性引物组合进行检测，对全部引物组合获得的待测品种和对照品种问DNA指纹谱带数据进行比较，两个品种问谱带无差异时，判定待测品种与对照品种为相同品种。附录A(资料性附录)本实验方法选用的我国北方地区10个杨村品种爰AFLP分析电泳图奉实验方法选用的我国北方地区10个杨树品种见表A 1。裹A 1 10个杨树品种一览表Populusdelmides Bartr c1_2KEN8 |匕京意大
27、W50橱夔#杨 P出h口z出=Mvsh cl_DrRva 7(5s65)107自R*橱 P x口舭Moench cLNe(7476) 北京意大利PcrMhcLGP“Mr口w Moench cLBellottoP口Moench cIJlaya“gP口Moench cl。214PrMoench“Se79P delmidesP 4“口clMincioP女n，幽MarshP mL尉da肿7(1 8S58)A 2杨树叶片基因组DNA纯化后O 8“琼脂糖凝胶电泳检测结果见图A i图A 1 扬树叶片基因组DNA纯化后08琼脂糖凝腔电泳检测结果A 3杨树基困组DNA经EcoR IMse l双酶切后与工接头连接
28、的0 8蹦琼脂糖凝胶电泳见图A 2(左第1带为标准DNA marker DL 2000；右第110镕*扬#B#)图A 2杨树基因组DNA经EcoR lMse I敷酶切后与人工接头连接的0 8琼脂糖凝胶电泳A 4杨树基因组DNA双酶切(EcoR IMse I)厦接头莲接后预扩增电诛结果见图A 3(左第i条带*标$DNAkrDL 2000，#第110条带为梧树品种)田A 3插树基因组DNA双酶切(EcoR IMse I)殛接头连接后预扩增电濠结果A 5利用计算机语言统计出的lO个杨树品种指纹图谱见表A2表A 2利用计算机谱盲统计出的10个檑树品种指纹图谱M-CAG M-CAG M-CAG M-CA
29、G M-CAC M-CAG M CAG M CAG M-CAG M CAGETA E-TA E-TA ETA E-TC E-TC E-TC E-TC E-TC E-TC230 bp 210 hp 120 bp 110 bP 500 bp 400 bp 350 bp 270 bp 190 bp 180 bp36橱50橱107橱108扬111杨1-214橱沙兰橱109插i10扬A 6 10个杨树品种AFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳条带见图A 436#50*107*108#1Il自*I 214*#!*I。*1lo*M CAGE TAt自。一一M CAG，E TA 23 一一MMn一 一一一M CAGn一一一M CAGBm一一MTCs一一一一 一一Mb1C一M CAG E TC一一MTC一M CAGE TCl一 一M CA0m TCl8_十 一 一图A 4 10个杨树品种AFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳条带
