1、户:才中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN /T 1048-2002 进出口粮食、饲料大麦品种鉴定蛋白质电泳分析法Cereais and feedstuffs for import and export -Identification for barley variety一Method of protein electrophoresis 2002 -0个16发布2002 - 06 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局SN /T 1048-2002 前本标准是按照GB/T1. 1-1993(标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定的要求进行编
2、写的，其中测定方法参照国内外有关文献，经研究、改进和验证后而制定的。本标准的附录A是提示的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:潘良文、陶军、关裕亮。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准1 范围进出口粮食、饲料大麦品种鉴定蛋白质电泳分析法Cereals and feedstuffs for import and export 一Identificationfor barley variety Method of protein electrophoresis 本标准规定了
3、进出口大麦品种鉴定的方法。本标准适用于进出口大麦品种的鉴定。2 引用标准SN/T 1048-2002 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版术均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。SN /T 0798-1999 进出口粮油饲料检验检验名词术语SN /T 0800. -1999 进出口粮油饲料检验抽样和制样方法3 定义除按照SN/T0798中的定义执行外，本标准还采用下列定义。3. 1 品种variety 在长期自然选择下生长的或经过人工培育出的作物的不同栽培种。3- 2 品种鉴定variety identi
4、fication 用物理的或化学的方法区分作物的不同品种。3. 3 醇榕蛋白质hordeins 种子中榕解于醇类的、能用含有醇类的缓冲液提取的一组储藏蛋白质。作物不同品种的种子内所含醇溶蛋白各组分不一样，各组分蛋白质受不同的基因，所编码。4 抽样和制样接照SN/T0800. 1中规定的方法执行。5 检验5.1 原理大麦的醇榕蛋白通过垂直平板电泳能有效地分离，经银染后得到电泳图谱，各种大麦的醇溶蛋白电泳图谱是品种的固有特性，对其进行比较分析可以鉴定大麦品种。5.2 试剂所有实验用试剂均为分析纯;除特别说明外，实验用水为蒸悟水或相应的去离子水。中华人民共和国国家质量监督检验检擅总局2002】01-
5、16批准2002 - 06 -01实施SN/T 1048 2002 5.2.1 50%丙醇缓冲液称取0.50g三起甲基氨基甲皖(Tr，加入25mL蒸榴水和50mL 1-丙晖，用棚酸调至pH8.6，加水定容至100mL，在4C下保存。5.2.2 提取液称取0.10g二硫代苏糖醇CDTT)，加入50%丙酶缓冲液10mL，在4C下保存。5. 2. 3 含有乙烯毗睫的缓冲丙醇溶液吸取72.0f1-L 4乙烯毗睫，用50%丙醇缓冲液定容至5mL，储于20C保存，配制后当天使用。5.2.4 0.5%澳酣蓝熔液称取0.50g澳酣蓝，加蒸饵水定容至100mL，在4C下保存。5. 2. 5 含有澳酣蓝的样品缓冲
6、液称取0.50g T巾，40.0g甘油和2.0g十二炕基磺酸铀(SDS)加入30mL蒸情水和4.0mL 0.5%澳酣蓝榕液，用唰酸调至pH8.6，加水定容至100mL。5.2.6 N，N，N，N四甲基乙二腊(TEMED)5.2.7 25%丙烯眈胶溶液称取61.25 g丙烯酷膀，1.25gN，N-亚甲双丙烯眈肢，用蒸榴水定容至250mL，用O.45硝基纤维素微孔膜过滤，在4C下保存。注:丙烯酌胶和N，N-亚甲双丙烯眈胶是神经毒素，在配制溶液、灌胶和染色过程中要带上防护手套。5. 2. 8 分离胶缓冲液称取60.55g Tris , 1. 33 g SDS，加入100mL蒸馆水，用盐酸。十1)调至
7、pH9.2，加水定容至200 mLo 5. 2. 9 被缩胶缓冲液称取15.14g Tris , 2. 5 g SDS，加入蒸馆水50mL，用盐酸(1十1)调至pH6.8，加水定容至100mLo 5.2.10 1 %过硫酸镜榕液称取0.05g过硫酸镜，用蒸馆水定容至5.0mL，配制后当天使用。5.2.11 上槽缓冲液 称取4.63g Tris ,l. 0 g SDS，加入OOmL蒸锚水，用棚酸调至pH8.6，加水定容至1000 mL。5.2.12 下槽缓冲液i 称取15.14 g Tris，加入200mL蒸情水，用盐酸(1+1)调至pH9.2，加水定容至1000 mL。5.2.13 固定液量取
8、900mL乙醇，240mL冰乙酸，加入860mL蒸悟水。每次固定时取150mL固定液，加入75L36%甲醒溶液。.5.2.14 45%乙醇溶液/ 量取900mL乙醇，加入1100 mL蒸馆水。5.2.15 硫代硫酸饷溶液称取0.10g硫代硫酸铀，加水500mL，配制后当天使用。5.2.16 硝酸银溶液称取0.60g硝酸银，加入225L36%甲醒溶液，加水300mL，配制后当天使用。5.2.17 碳酸铀溶液称取18.0g碳酸饷，加水至300mL。5.2.18 显影液取硫代硫酸铀溶液6mL，加入150L36%甲醒溶液和294mL碳酸铀榕液，显影前配制。5.2.19 低分子量标准蛋白质溶液(4000
9、0100 000道尔顿)。5. 3 仪器设备2 SN /T 1048-2002 5. J 1 垂直平板电泳系统。5. J 2 台式离心机最高转速16000 r/mi日。5. 3. 3 离心管通常使用1.5 mL聚丙烯塑料离心管。5. J 4 凝胶成像系统。5. J 5 水浴锅。5. J 6 微量加样器:0.5L2. 5L，2L20L，10L100L，200Ll 000L 5.4 试验方法5.4.1 大麦醇溶蛋白质的提取5.4. 1- 1 取颗粒饱满、外观、色泽、气味正常的单粒大麦，将麦粒用滤纸包裹住，压碎麦粒至粉末状。5.4. 1- 2 将粉碎的麦粒完全移入1.5 mL的离心管内。5.4. 1
10、- 3 向离心管内力11人500L提取溶液，振荡2min，在60C水浴】中加热30min , 8 800 r /mill离心10 mino 5.4. 1- 4 取50L的上清液于1.0mL的离心管内，同时加入含有己烯毗睫的缓冲丙醇帘液，振荡1 min，在60C7c谷中加热15mino 5.4. 1- 5 加入100_(L含有澳酣蓝的样品缓冲液，振荡1mino抽提液在室温下可保存2d3d。5.4.2 制备分离胶和改缩胶5.4.2.1 制备分离胶根据电泳平板的大小确定灌胶量，各种溶液的用量可按下列比例进行调整。取9.60mL 25%丙烯酷肢洛液.7.18mL重蒸馆水.3.00mL分离胶缓冲攘，抽气
11、2min，加入24LTEMED，最后加入224L 1%过硫酸锻溶液。将以上溶液充分混匀后迅速灌注到制胶模板中，灌注的分离胶溶液高度以距插入的梳子齿下方1cm处为宜，用双蒸水将分离胶溶液表面铺满，聚合Lbl。倒出分离胶表面的重蒸锢水，沥干;加入少量的浓缩胶缓冲液清洗分离胶表面，沥干。5.4.2.2 制备浓缩胶取2.40mL 25%丙烯酌肢溶液，6.96mL重蒸锢水，400L浓缩胶缓冲液，抽气2mn.加入15LTEMED和240L1%过硫酸锻珞液，将以上溶液充分混匀。将样品梳插入模板中，将充分混匀的浓缩胶榕液加入分离胶上部的模板中，浓缩肢溶液聚合45min。5.4.3 加样待浓缩胶洛液聚合后，垂直
12、向上移去样品梳，并用上槽缓冲液冲洗。分别向上槽和下槽中加入上槽缓冲液和下槽缓冲液。用微量加样器加入低分子量标准蛋白质溶液，作为蛋白质的分予量标记;加入1.0L大麦标准样品的提取液，作为对照。加1.0L待测大麦样品提取液进行测试分析。靠近最旁边的两侧齿槽不加样品，以避免产生变形的蛋白条带。注:不同型号的电泳槽，所需加入的大麦田享溶蛋白的量有所不同，可通过试验确定最适加样量。5.4.4 电泳使用带有水浴的电泳槽进行电泳，水浴温度维持在20C左右，注意掌握电流、电压和电泳时间，不同型号的电泳仪所需的电压、电流和电泳时间不同，二般以每片凝胶90mA的恒定电流进行电泳，根据澳酣蓝的迁移来决定电泳时间。5
13、.4.5 电泳凝胶的固定与染色5.4.5.1 将电泳凝胶用固定液固定至少1h.用45%乙醇溶液洗2次，每次15min 。用硫代硫酸铀溶液预处理1mm。用蒸f留水洗3次，每次20s 0 5.4.5.2 用硫酸银恪液浸泡15min，用蒸馆水洗2次，每次20s 。用显影液显影约2min。用水洗2次，每次2mi丑。5.4.5.3 用固定液浸泡10min.停止显影反应，将胶片储藏在45%乙醇搭液中。3 SN/T 1048-2002 以上各操作均在脱色摇床上进行。5.4.6 电泳图谱记录将储于45%乙醇溶液中的电泳凝胶片，移入蒸馆水中，待凝胶片扩张至正常大小后，用凝胶成像系统或照相机记录电泳结果。6 结果
14、处理与分析6.1 巳知品种的鉴定如果需鉴定己知品种名的大麦，则将该大麦的标准品种与待鉴定的大麦一起进行电泳测试分析。若电泳图谱完全一致，则待测品种即为该品种，反之，待测品种就不是该品种。如果没有标准品种作为对照，则采用6.2的方法进行鉴定(几个加拿大大麦品种的SDS-PAGE图谱见附录A)。6.2 未知品种的鉴定如果需鉴定未知品种名的大麦，则将待鉴定大麦的电泳图谱与所收集的大麦标准谱电泳图谱进行比较，若待测样品的电泳图谱与某一品种相一致，则待测品种即为该品种。4 97400道尔顿66200道尔顿43000道尔顿SN /T 1048-2002 附录A(提示的附录)几个大麦品种的SDS-PAGE图
15、谱2 3 5 1 Argyle ; 2 Klages; 3 Manley; t! Stein; S-B1215;6-Harrington;7-AC Oxbow 图Al儿个大麦品种的SDS-PAGE图谱6 7 J NOON寸CFFMLZ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口粮食、饲料大麦品种鉴定蛋白质电泳分析法SN/T 1048-2002 奇峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当k印张3/4字数12千字2002年5月第一次印刷开本880X12301/16 2002年5月第一版印数1-2000 :n:; 定价10.009唔书号:155066 2-14411 网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1048-2002
