1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1059.5-2006 食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法免疫磁珠法Inspection method for the detection Escherichia coli 0157 from food and animal feeding stuffs-Immunomagnetic separation CISO 16654: 2001, Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Escherichia coli
2、 0157 , IDT) 2006-08-28发布061214000321 2007-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1059.5-2006 前本部分为SN/T1059的第5部分。本部分等同采用ISO16654: 2001(E)(食品和动物饲料微生物学一一大肠杆菌0157的检测方法(英文版)。为便于使用，本部分做了下列编辑性修改za) 本国际标准一词改为本部分;b) 用小数点气代替作为小数点的逗号，;c) 删除国际标准的前言;d) 为了更符合中文习惯，本部分的名称稍做修改。本部分附录A为资料性附录。本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。本部分起草单位:中华
3、人民共和国河南出入境检验检疫局。本部分主要起草人:苗丽、李志培、张巨洲、李苛、江志毅、杨向莹、乔晴。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法免疫磁珠法SN/T 1059.5一2006警告:大肠杆菌0157是-种可以引起严重的危及生命的疾病，并且很低的剂量就可以引起感染的致病菌。曾经有实验室获得感染的报道。整个方法只能由那些采用良好实验室规范CGLP)、具有丰富经验的人员去实施，并且最好在-个可控设施中进行，以保护实验室人员的安全。必须遵守有关的健康和安全的法规。传染性材料的处理必须谨慎。1 范围SN/T 1059的本部分规定了检测大肠杆菌0157的
4、免疫磁珠法。本部分适用于人类消费的食品或用作动物饲料的产品。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1059本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ISO 6887-1 食品和动物饲料微生物学一一实验样品制备、初始悬液和稀释液的微生物学检测一一第1部分:制备初始悬液和稀释液的通用规则ISO 7218 食品和动物饲料微生物学一一微生物学检测通用规则3 术语和定义3. 1 下列术语和定义适用于SN/T
5、1059的本部分。大肠杆菌0157E. coli 0157 在本部分中使用的平板培养基表面上形成典型菌落，产生呵!喋并且与0157抗血清发生特异性凝集反应的细菌。注1:山梨醇阳性的E.coli 0157菌株在CT-SMAC培养基中观察不到。注2:已发现有一些呵|噪阴性的变异株。4 原理大肠杆菌0157的检测应有以下4个连续步骤(参见附录A): a) 增菌:测试部分样品在41.50C士lOC下，用含新生霉素的改良膜蛋白陈大豆肉汤(mTSB+N)的样品均质液孵育6h，之后再培养12h18 h进行增菌。b) 富集纯化:使用包被有E.coli 0157抗体的免疫磁珠分离并富集细菌。c) 分离:将粘附有
6、细菌的免疫磁珠转移到亚蹄酸伺山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC)和其他E.coli 0157选择性分离培养基上进行分离培养。d) 确认:对于CTMAC上的山梨醇反应阴性菌落和其他类型分离平板上的典型E.coli 0157 菌落，通过是否产生呵!喋以及是否与E.coli 0157抗血清产生凝集反应进行确认。注:对阳性分离株的病原性特征的进一步鉴定，可以送到有关参考实验室进行。SN/T 1059.5-2006 5 培养基、试剂和抗血清5. 1 增菌培养基含新生霉素的改良膜蛋白膀大豆肉汤(mTSB+N)5. 1. 1 改良膜蛋白陈大豆肉汤(mTSB)5. 1. 1. 1 成分膜酷蛋白陈植物蛋白陈b葡萄
7、糖3号胆盐氯化锅磷酸氢二饵蒸馆水5. 1. 1. 2 制备5. 0 g 4.0 g 将各成分或合成脱水培养基溶菌后250C时pH值为7.4土o.2 进行加热，必要时用pH计调整pH值，使灭将培养基适量分装到用高压灭菌锅1210C5.1.2 新生.素溶液5. 1. 2. 1 成分新生霉素蒸馆水5. 1. 2. 2 制备100 mL 将新生霉素溶解在水中并用滤里过吨除菌。使用当天制备。5. 1.3 完全培养基的制备5. 2.1 基础培养基5.2. 1. 1 成分膜酷蛋白陈动物组织蛋白陈山梨醇3号胆盐氯化铀中性红结晶紫0. 001 g 琼脂9 g18 g 蒸馆水1 000 mL 注:琼脂量根据凝胶硬
8、度酌情添加。5. 2. 1. 2 制备TSB中。新生霉素的最终将基础培养基的各成分或合成脱水基础培养基溶解到水中并煮沸使其充分溶解，必要时，调整pH值使灭菌后250C时pH值为7.1土O.2。高压灭菌锅中1210C灭菌15min。5.2.2 亚硝酸饵溶液5. 2.2. 1 成分细菌学用途的亚暗酸饵蒸锢水5.2.2.2 制备0. 25 g 100 mL 将亚暗酸饵溶解在水H=并通过滤膜过滤除菌。E咽该溶液可以在室温下储存1个月，但如果有白色沉淀物形成时就丢弃不用。5.2.3 头抱克肝溶液5.2.3.1 成分头抱克月亏蒸馆水注:头抱克肝可能需要在乙醇中攘解d该溶液可以在30C土2p环境中贮存阴。5
9、.2. 4 完全培养基5. 2. 4. 1 成分基础培养基(5.2. 1) 亚暗酸饵溶液(5.2.2)头抱克肝熔液(5.2.3)5.2.4. 2 制备1000 mL 1. 0 mL SN/T 1059.5一2006将灭菌好的基础培养基(522去却手44oc416工或写ht灭过菌但已经凝固了的基础培养基通过热蒸汽使其融化后再岛至4430 min，或盖上盖子过夜使其干燥。|如果预先已制备，未书户的琼B+板可以20C冰箱中可以贮存2周。5. 3 其他类型选择性分离E. coli 0157。使用前立即干燥琼脂平板，最ZE穆开盖f让琼脂面朝fLr置平温度在250C 500C的烘箱(6.2) 中，直到培养
10、基表面的水滴消失，此时就不需再继续干燥，琼脂平板也可以半开盖子放在层流安全柜中30 min，或盖上盖子过夜使其干燥。5.4 营养琼脂5.4. 1 成分牛肉浸膏蛋白胖、琼脂3. 0 g 5. 0 g 9 g18 g 3 SN/T 1059.5-2006 蒸铺水1 000 mL 注:琼脂量根据凝胶硬度酌情添加。5.4.2 制备将各成分或脱水合成培养基溶解到水中，如果需要的话进行加热，必要时调整pH值，使其灭菌后250C时pH值为7.0:l: 0. 2。将培养基适量分装到合适容量的三角烧瓶或其他瓶子(6.7)中。高压灭菌锅中1210C灭菌15min。5.4.3 制备营养琼脂平板每个平皿中倾注约15m
11、L熔化后又冷却至44oC 470C的培养基，并使其凝固。使用前干燥琼脂平板，最好是移开盖子，让琼脂表面朝下，置于温度在250C50oC的烘箱(6.2)中，直到培养基表面的水滴消失，此时就不需再继续干燥，琼脂平板也可以半开盖子放在层流安全柜中30 min，或盖上盖子过夜使其干燥。5.5 腊蛋白臆/色氨酸培养基5.5.1 成分膜蛋白陈氯化铀DL色氨酸蒸馆水10.0 g 5.0 g 1. 0g 1 000 mL 5.5.2 制备将各成分榕解到水中，必要时进行加热煮沸，调整pH值使灭菌后250C时pH值为7.5:l: 0. 2。分装到合适容量的试管或瓶子中，每管5mL。高压灭菌锅(6.1)中1210C
12、灭菌15min。5.6 Kovacs用i睐试剂5.6. 1 成分对-二甲氨基苯甲醒戊醇5.0 g 75.0 mL 盐酸(z。为1.18 g/mL1. 19 g/mU 25.0 mL 5.6.2 制备将对-二甲氨基苯甲醒溶解到戊醇中，必要时水浴加热，水浴温度保持在440C470C，冷却至室温后加入盐酸，用棕色的玻璃瓶避光保存于30C:l:20C的温度环境中，试剂将变为黄色或浅棕色，并且无沉淀物析出。5. 7 抗大肠杆菌0157免瘟磁珠这些免疫磁珠表面涂布有抗E.coli 0157的特异性抗体，可以富集并分离这些微生物。注:这些磁珠可以通过商业途径获得。应当准确地按照生产商的说明书进行磁珠使用前的
13、制备。5.8 缓冲洗涤液(改良磷酸盐缓冲液0.01mol/L,pH7. 2) 5.8. 1 成分氯化饷8.0 g 氧化饵0.2 g 无水磷酸氢二纳1. 44 g 无水磷酸二氢押0.24 g 吐温20蒸馆水0.2 mL 1 000 mL 5.8.2 制备将各成分溶于水中，必要时调整pH值，使其在250C为7.2士O.2。4 SN/T 1059.5-2006 分装到合适容量的瓶子或三角烧瓶(6.7)中备用。高压灭菌锅中1210C灭菌15min，溶液可能会出现由浊，但静置后会变得清澈。通过商业途径获得的具有同等成分和同样性能的磷酸盐缓冲液可以使用。5.9 标准盐水溶液5.9.1 成分氯化铀蒸榴水5.
14、9.2 制备8. 5 g 1 000 mL 将氯化铀溶解到水中，分装到合适容量的瓶子或三角烧瓶(6.7)中备用。高压灭菌锅中1210C灭菌15min。5.10 E. coli 0157抗血清既可以通过专业实验室获得，也可以通过商业途径获得以用于分离菌体0157抗原用。抗血清在使用于未知的分离物前应先用阳性和阴性菌株进行质控测试。6 仪器和玻璃器皿常规的微生物设备(见ISO7218)和下列专用设备。6. 1 干热灭菌设备(干烤箱)和(或)湿热灭菌设备(高压锅):见ISO7218 0 6.2 干燥箱或培养箱:温度能保持在250C500C。6.3 培养箱z温度能保持在370C:!:lOC。6.4 培
15、养箱:温度能保持在41.50C土lOC。6.5 水浴锅:温度能保持在440C470C。6.6 pH计:250C时，刻度要精确到0.01，测量结果能精确到O.1。6.7 合适容量的灭菌测试试管、三角烧瓶或其他容器:贮存培养基和孵育液体培养基用。6.8 合适容量的量筒:制备稀释液和完全培养基用。6.9 刻度移液管:容量1mL和10mL，刻度0.1mL和0.5mL。6. 10 接种环和接种线:由白金/依或镰/锦制成。或经巴氏消毒过的吸管或一次性接种环。6. 11 移液器:灭菌，操作范围从20L200L，刻度10L或相当。6. 12 带有磁架的磁性分离器z聚集免疫磁珠，配合Eppendorf管使用。6
16、. 13 Eppendorf管:带帽，灭菌，一次性，可离心，容量1.5 mL。适合磁架上使用，打开盖的时候要防止产生气溶胶。6. 14 旋转混合器(风车型，血样混合器):转速为15r/min20 r/min。6. 15 培养皿:直径90mm和140mmo 6. 16 旋涡混合器。7 取样确保实验室收到的样品真实、有代表性，并且在运输和贮存的过程中不得损害或改变，这一点非常重要。建议:贮存前迅速冷却样品。8 测试样晶的制备按照适合于相关产品的特定的国际标准制备实验样品，如果没有专门的国际标准，建议有关各方在制备样品问题上达成一致意见。5 SN/T 1059.5-2006 9 程序9.1 测试部分
17、样品和初悬液见ISO6887-1和其他适合于相关产品的特定的国际标准。一般来说，制备初始悬液，要将(X)g或(X)mL的测试部分样品加到(9X )mL或(9X)g含新生霉素的改良膜蛋白陈大豆肉满阳市5B中Tn-t5:l)中7田PS:嗣司叶要先在插在辅仁4)中预热到41.50C ，测试部分样品和mTSB+N的比例质量体积比或体积体积比为1I 10.建议使用带网丝的均质袋以减少食物微粒对免疫捕获的干非。9. 2 增菌按照9.1制备好的初悬液在41.50C培养箱(6.的中墙果继续培养18h后再转种，该结果可吉拉变成阴性。9. 3 免疫磁珠分离(lMS)9. 3. 1 通则琼1旨平板上可以获得可疑的阳
18、性结果，如免疫磁珠分离应该在46h后进行矿也要时，也可以继续培养12h川后再分离一次。下面的介绍为一般性曲指导，可能不会在所有的细节上都描述得完整1因此，应当按照有关免疫捕获仪器和装置的程序及方法的说明进行操作。9.3.2 免症捕夜菁告:使用无菌技术以防止任何外部的污染和产生气溶胶。必要时，戴上手套，在生物安全柜里进行操作。用磁性分离器(6.12)和包被抗体的免疫磁珠(5.7) ，去成以J自获分离步骤。棍合增菌培养液(9.2) ，沉tiEJiJJ布的南糙食物残、。室温下，在Eppendorf管里，加20L准备好的免疫磁珠(5.7) ，从增菌培液中移取1mL 层液体加入Eppend，rf管中，要
19、尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒。疫磁珠聚集到磁极。小心将离心管从磁性分离器kp开，并加100L庆菌的洗吗(5.8)到哇5，重悬磁珠。注如果检测脂肪类产品和新鲜奶眨F，该程序j罢休缸来会有一?难度./9. 4 接种选择性培养基并鉴定E.coTrurs7菌落9.4. 1 接种用一个移液器(6.11)，吸取50L洗过并重悬的免疫磁珠加到一个预先干燥好的CT-SMAC(5.2)平板上，另取50L加到另一种预先干燥好的选择性培养基(5.3)上。用一个无菌接种环(6.10)将磁珠液进行划线，以便在琼脂平板上得到大量分离很好的菌落。将CT-SMAC(5.2)平板在370C培养箱(6.3)中培养18h24
20、 h，另一种选择性培养基也要在其推荐的温度和指定的时间内进行培养。由于食物样品种类和它的微生物菌丛不同，营养肉汤增菌液培养20h24 h，会使杂菌在选择性琼6 SN/T 1059.5-2006 脂平板上过度增长而使得E.coli 0157菌落很难辨认，用制备好的IMS稀释液接种选择性琼脂平板或每个平板接种量不超过50L，可以增加获得E.coli 0157分离菌落的机会。但要注意，这也相应地提高了检测限。9. 4.2 辨认典型的E.coli 0157菌落在CT-SMAC琼脂板上，典型菌落呈透明状，很浅的似黄似褐的颜色，几乎无色，直径大约1mm。按照产品说明书，检查接种的第二种选择性分离平板上的典
21、型的E.coli0157菌落。9.5 确认注:在用已知阳性和阴性睛种开展适当实验进行确认的情况下，可以使用商品化的被型生化鉴定试剂盒和E.coli 0157乳胶试剂盒，它刊都可以用来鉴定山梨部阴性和呵|蝶阳性的大肠抨菌.9.5.1 挑选菌落每个平板上挑选5个9.4中的典型菌落，如果-7运上不足5倒主脯，那么所有的典型菌落都应该鉴定。将挑选的每一个菌落分别划线接种到三呼絮琼脂平步t5.4)，以便使分离的菌落很好地生长。将平板置于370C温箱(6.3)中培养J8h-24h。加入1mL Kovac氏i茸剂(5.的，并在室温下放置10min。出现红色代表阳性反乎，黄/褐色代表阴性反应。9. 5.3 血
22、清学鉴定为均一性的?昆浊悬液。往后进行，因为该菌与专9.5.3. Z那样在一滴新鲜盐水中制成悬液，然后加一小滴E.coli 0157抗血清(5.10)。如果1min内出现凝集，则该反在为阳J性。9. 5. 3.4 阳性鉴定那些呵|喋阳性、能与01或0157: H7抗血9. 6 进一步鉴定为了进一步鉴定阳性菌落的话毛挤原和10 质量保证10.1 用作质量保证目的的实验菌株不携带有致病性毒力因子的E.coli 0157菌株可通过国家或国际的菌种收藏机构获得。建议这些菌种作为检查培养基和抗血清的质量保证。10. 2 培养方法使用本标准描述的方法验证实验室和培养基检测食品检样中含少量大肠杆菌0157的
23、能力时，要7 SN/T 1059.5-2006 接种少量无致病性的E.coli 0157的参考样品和大量其他E.coli的参考样品做平行试验。11 结果表示根据结果的解释，报告检测样品中检出或未检出E.coli 0157，要用质量克数或容积毫升数为单位来确切说明测试样品的数量。12 试验报告试验报告应明确表述以下内容za) 完成样品鉴定的所有信息;b) 使用的取样方法(如果知道hc) 使用的试验方法;d) 培养的温度;的本部分中未作规定的所有操作细节，或认为是可选择的细节，连同任何可能会影响结果的细节pf) 测试结果，如果进一步的试验是由参考实验室完成的，这个实验结果也应在报告中说明。8 附录
24、A(资料性附录)程序图解测试部分样品(X) g或(X)mL (9 X) mL mTSB (5. 1) (预温到41.5 .C ) 均质后培养6h.然后再进一步培养12h18 h (41. 5.C ) 通过免疫磁珠的捕获富集E.coli0157.然后再用灭菌缓神液洗涤用0.1mL的灭商缓沸液中重新制成悬液吸取50L已经洗涤过并重新制成悬液的免疫磁珠接种到选择性培养基上以获得分离菌落CT-SMAC培养基(5.2)另一种选择性培养基(5.3)37.C孵育18h24 h 在其推荐的温度和特定的时间内培养挑选5个典型的山梨醇阴性菌落通过呀!昧的形成(9.5.2).使用商品化的生化鉴定试剂盒(9.5)并结
25、合E.co/i0157抗血清的血清学鉴定(9.5.3)来确认纯菌落(9.5.1)进行更进一步的确认，培养物应送往相关的参考实验室进行固A.1程序固SN/T 1059.5一20069 CON-m.白山OFFML军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法免症磁珠法SN/T 1059.5一2006 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷呼开本880X12301/16 印张1字数18千字2006年11月第一版2006年11月第-次印刷印数1-2000峰书号:155066 2-17273 7G 定价10.00
