1、l!3才己|中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN /T 1106-2002 橡胶南美叶疫病菌检疫鉴定方法Methods for the quarantine and identification 。fsouth ameri.can leaf blight Microcyclus ulei CP. Henn. ) Von Arx in rubber tree 2002 - 05 -20发布2002 -11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘟总局SN /T 1106-2002 前言橡胶南美叶疫病是我国进境植物检疫危险性病害。为了防止该病菌随寄主传入我国，需正确掌握橡胶南美叶疫病菌的
2、检疫鉴定方法。本标准在制定过程中，分析了国内外有关资料，总结了多年来植物检疫经验，根据橡胶南美叶疫病菌的形态学、生物学特性及植物病理学原理，确定各项鉴定技术指标。本标准给出橡胶南美叶疫病菌的有性态和无性态的形态特征，以及在寄主上所表现的病征和病状，鉴定时可以综合采取有性态和无性态的形态特征，或者其中的一个世代的形态特征作为鉴定依据。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人z林石明、余芳平、陈勇。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN /T 1106-2002 橡胶南美叶疫病菌检疫鉴
3、定方法1 范围本标准规定了进境植物检疫中橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境三叶橡胶属CHeveaspp. )植物的芽条、芽穗、萌果等繁殖材料的橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定。2 原理橡胶南美叶疫病菌是活体营养真菌，可以侵染三叶橡胶的叶片、枝条、茎杆、花序、葫果，造成橡胶树的持续落叶。该病菌有3种类型的繁殖体，即子囊于包子、器J包子和分生于包子。该病菌可依据其极具扭曲的元性态的分生于包子特征，有性态的形态特征和生物学特征，以呆在三叶橡胶属植物上的症状特征进行鉴定。3 仪器、试剂3. 1 手持式扩大镜。3. 2 双目解剖镜(lOX50X)。3. 3 显微镜(lOOXlOOOX)。3. 4
4、 切片机。3. 5 小器具和器皿1:刀片、解剖刀、解剖剪、筷子、记号笔、酒精灯或煤气灯、纱布、烧杯、搪瓷杯、移植接种针、移植环、培养皿、烧杯、三角瓶、玻片、盖玻片、铝铀纸、Parafilm膜等。3. 6 超净工作台。3. 7 乳酣油:由苯酣(由水浩加热融化)20mL、甘油40mL、乳酸20mL、蒸馆水20mL I昆合配制而成。3. 8 次氯酸锅。3. 9 酒精。3. 10 琼脂。4 现场检擅查验待检货物的有关单证，核实产地、包装、暖头、品名及数量。逐件检查橡胶树繁殖材料的芽条、芽穗、葫果等是否有可疑疫情，重点应检查叶片。对于来自疫区的材料，还应仔细检查装载交通工具和包装材料。然后，直接抨取有可
5、疑症状的部位;如果没有发现任何可疑症状，则按5%的繁殖材料比例抨取样品，带回实验室检查;如果样品数量少于10件，则全部杆取。5 检验方法5.1 症状检查仔细检查橡胶的叶片、枝条、茎杆和葫果尤其是嫩叶是否有橡胶南美叶疫病感病症状。该病的病斑通常有半透明的榄绿色斑点，暗淡青灰色或发黑，穿孔。叶片卷曲，畸形，皱缩变黑呈火烧状。病斑的背面灰白色，其上密生绒毛物(即分生抱子梗和分生抱子)，病斑的四周轮生小黑点(即分生于包子器或子座)。叶柄呈螺旋状扭曲。花序变黑、卷缩。枝条、茎杆坏死。果实上有隆起的褐色病斑。在感病组织上，SN/T 1106-2002 最常见是散生的分生于包子梗和其上所产生的分生于包子。5
6、.2 病原菌检查用解剖针挑取或刀片刮取病斑上的绒毛状物，制片，在显微镜下直接检查有无病菌的子实体，记录其形态特征，必要时还应测量分生于包子梗和分生抱子的大小。在解剖镜下检查可疑病斑上的小黑点，切取带有病菌子实体的组织，用冰冻切片机或手工将组织切成厚度约为10m20m的薄片，制片，在显微镜下检查子囊壳和/或分生抱子器，记录形态特征，并测量大小。5.3 分离培养如果发现可疑症状，或没有发现该病菌的任何子实体，应采取分离、培养的方法作进一步鉴定。直接刮取病斑上的分生抱子放入HMA培养基(参见附录A.2)培养，或选择新鲜病组织(叶片、枝条或葫果的表皮组织)，切成小块，用70%酒精消毒几秒钟后，置于3%
7、次氯酸铀水溶液中消毒5min15 min，再用灭菌水连续泡洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后移置在HMA培养基平板上、于240C280C下培养。6 鉴定特征6. 1 形态特征6.1.1 有性态子囊壳阶段MicrocycluleiCP. Henn. ) Von Arx in Ml1er & Von Arx; = Dothidella ulei P. Henn. ; =Melanossammo户sisulei CP. Henn. ) Stahel ，属子囊菌门CAscomycota)，座囊菌目CDothideales) ，小球腔菌科CMycosphaerel1aceae)，小环座囊菌属CMicrocyc
8、lusSacc. ,Syd. & P. Syd. ，1904)。其形态特征为:子座球形或近球形，碳质，表生于叶片或植物组织上，通常聚生，有时着生于穿孔病斑的周围，直径200m450m，但常侧面融合;拟薄壁组织的细胞壁均匀加厚，色暗;子座内有一个至多个腔，成熟时具乳突状孔口。子囊壳散生，具乳突状孔口，内径100m200m。子囊从腔的基部长出，有侧丝，双层壁，棍棒形，顶端稍厚，大小为(5080)t-tmX(l216)m，具8个近双行排列的子囊抱子。子囊抱子无色透明，单隔膜，分隔处维缩，近椭圆形，2个细胞不相等，较长的一端顶端较尖，朝下排列，大小为(l220)mX (25)mo参见附录A之图A.1。
9、6.1.2 无性恋该病菌有两种类型，一类是分生于包子器和器分生也子，另一类只产生散生的分生抱子梗，其上着生分生抱子。6.1.2.1 橡胶离球壳菌(Aposphaeriaulei P. Henn. ) 分生于包子器黑而发亮，碳质，圆形或椭圆形，表生，具乳突状孔口，直径为120m160m，单腔，薄壁，由浅褐色、厚壁的角细胞组成外层，由更薄的、无色透明的小细胞组成内层。于包子梗由分生于包子器的内壁细胞长出，无色透明，于基部分枝，丝状，大小为(1220)t-tmX(23)m。产于包细胞内壁芽殖，瓶梗型，聚生或离散生，无色透明，表面光滑。器于包子哑铃形，直或稍弯，无色，常含2个3个油滴，单胞，大小为(6
10、10)t-tmX(0. 81)t-tm。6. .2.2 大抱黑星抱(Fusicladiummacrosporum Kuyper) 属有丝分裂真菌(Mi让to臼spo盯n比cFungi)，丝抱纲(Hypho旧omy严cet臼es)，黑星菌科(Vent阳u盯na胆ceae)，黑星抱属(Fu削仰Slclad础叩.￥umB胁ono旧or时den，1851)。其形态特征为:菌落散生，灰色，粉状。菌丝体埋生。子座表生，由相当松散的细胞组成。分生于包子梗由表皮下的子座伸出，初为单胞，后期形成多个隔膜而基部为亚球形膨大(宽约10m)，由无色透明变成灰榄褐色，直或稍为弯曲，有时为曲膝状，具1个4个抱痕，有时长度
11、可达140m，但是通常小于50m，宽3m7m。产抱细胞合轴状芽殖。分生于包子顶生，单生，直或弯曲，椭圆形或长梨形，初无色，后变成淡灰褐色，光滑或具微小的疵突，通常具1个隔膜，偶而单胞。双细胞的分生抱子于分隔处锺缩;靠基部的细胞较宽，基部截形、加厚，经常具有典型特征性的单向扭曲;其大小为:长(2363)m，平均45m，最宽处于包子的宽度(510)t-tm，平均8.5m。单细胞的分生于包子大小为:(l543)mX (59)m。分生抱子基部的抱痕宽为(2.54)m。参见附录A之图A.20SN/T 1106-2002 6.2 培养特征在HMA培养基上，菌落生长很慢，首先产生橄榄绿色的菌丝体，后形成淡黑
12、色的、埋生或表生的子座组织。表生的结构是大量的分生于包子器，并在子座的表面产生分生抱子;埋生的结构主要是菌丝体和分生于包子，在培养基表面为橄榄绿色。培养26d后菌落直径为5mm6 mm。6. 3 生物学特征子囊抱子和分生于包子的最适萌发温度为240C28C、最适pH值为7.8。在露水或雨滴中要8d后萌发，产生附着胞、侵染菌丝，直接穿透叶片的角质层而侵入寄主植物组织，5d8 d后产生症状。7 结果判定以橡胶南美叶疫病菌在三叶橡胶属植物上产生的症状，有性态的子囊壳、子囊、子囊于包子以及6. 1. 2. 2所描述的分生抱子梗和分生抱子的形态特征为鉴定依据，进行综合判定。器抱子的特征作为检疫鉴定的参考
13、依据，不能单独作为鉴定的依据。8 检疫处理与样晶保存8.1 检症处理如果检出橡胶南美叶疫病菌，则应对该批货物及其包装铺垫材料等全部进行销毁，并对交通工具作消毒处理;如果没有检出橡胶南美叶疫病菌，则应将全批货物在隔离温室内作至少一个生长周期的隔离试种、检疫观察。8.2 样品保存发病的繁殖材料应及时销毁。可将病菌制成永久玻片，或培养物经过高温灭菌后保存。3 SN /T 1106-2002 附录A(资料性附录)橡胶南美叶瘟病菌的形态特征及HMA培养基A.1 橡胶南美叶瘟病菌橡胶南美叶疫病菌分为有性态(见图A.l)和无性态(散生的分生抱子梗和分生抱子，见图A.2)。1一子座;2 子囊壳;3 子囊;4一
14、子囊袍子。单位为微米八门门n川H川10 峦艺坠3 固A.1橡胶南美叶擅病菌的有性态单位为微米固A.2橡胶南美叶瘟病菌的无性态注2散生的分生于包子梗和分生抱子。4 SN /T 1106-2002 A.2 HMA培养基20 g三叶橡胶树叶片的提取液制做方法z将20g干叶片切成方形小块，用适量的蒸馆水(约50 mL)煮30min后，过滤去除残渣，取其滤液、2.5g麦芽计、20g琼脂，加蒸锢水至1000 mL , 121C 下湿热灭菌30min。5 NOON-OF同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准橡胶南美叶症病菌检瘟鉴定方法SN/T 1106-2002 奇峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9号印张3/4字数9千字2002年9月第一次印刷开本880X12301/16 2002年9月第一版印数1-20007G 9毛定价8.00 网址书号:155066 2-14711 版权专有侵权必究举报电话:(010)685335331106-2002
