1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1664一2005牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M，、B，、B2、G，、G2含量的测定Determination of aflatoxin M，、B，、B2、G，、G2content in milk and milk powder (lSO 14501 :1 998 Milk and milk powder Determination of aflatoxin M1 content Clean-up by immunoaffiniy chromatography and by high-performance liquid chromatography,
2、MOD) 2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国警世国家质量监督检验检疫总局。060509000075 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M，、B，、B2、G，、G2含量的测定SN/T 1664一2005* 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880X12301/16 印张1.75 字数45千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数12000 9峰书号，155066.2-16591 定价14.00元SNjT 1664-2005
3、 前本标准修改采用ISO14501: 1998(牛奶和奶粉一一黄曲霉毒素M1含量的测定一一一通过免疫亲和色谱净化和高效液相色谱测定以英文版)。本标准根据ISO14501: 1998重新起草。为了方便比较，在资料性附录A中列出了本标准条款和国际标准条款的对照一览表。由于本标准对免疫亲和柱的性能进行了测试，将其适用范围进行了扩展等，本标准在采用国际标准时进行了相应的修改。这些技术性差异用垂直单线标识在它们所涉及的条款的页边空白处。在附录B中给出了技术性差异及其原因的一览表以供参考。为便于使用，本标准还做了下列编辑性修改:的本国际标准一词改为本标准气b) 用小数点代替作为小数点的逗号，;c) 删除国
4、际标准的前言、附录和参考文献。本标准的附录C、附录D为规范性附录，附录A、附录B、附录E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:李佐卿、康继韬、孙大为、章再婷、谢东华、俞雪钧。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 1 范围牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定SN/T 1664-2005 本标准规定了利用免疫亲和柱和高效液相色谱法测定牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2含量的方法。本标准适用于测定牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2的含量。本标准同
5、样适用于低脂和脱脂牛奶，低脂和脱脂奶粉。对奶粉的最低检测限是0.08g/kg，对牛奶的最低检测限是0.008g/L。2 测定方法2.1 原理试样通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M1、BI、岛、G1、马被提取。特性抗体键合在亲和柱固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性地与存在的黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、马(抗原)键合，形成抗体抗原复合体。停留在亲和柱上的样品中干扰基质用水淋洗掉。然后用洗脱液将亲和柱上的黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2洗脱下来，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪(HPLC)测定洗脱液中黄曲霉毒素MI，BI、B2、G1、Gz含量。2.2 试剂和材料除非特别
6、注明，所用试剂均为分析纯;使用蒸馆水、去离子水或其他相当纯度的水。2.2.1 免疫亲和柱z免疫亲和柱应该含有黄曲霉毒素M1、BI、岛、G1、G2的抗体。亲和柱的最大容量不小于100ng黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2(相当于50mL浓度为2g/L的试样)、当标准溶液含有4 ng黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2(相当于50mL浓度为80ng/L的试样)时回收率不低于80%。任何满足这些技术指标的免疫亲和柱均可采用。应该经常检查亲和柱的技术性能，对于每个批次的亲和柱至少检查一次(见附录。2.2.2 正己烧。2.2.3 三氟乙酸(99%)。2.2.4 异丙醇。2.2.5苯。2.2.6 氮
7、气。2.2.7 乙睛:色谱级。2.2.8 乙睛+异丙醇+水(8+12+80)，流动相(使用前需要脱气?昆溶)。2.2.9 10%乙睛溶液:将10mL的乙睛(2.2.7)加入90mL的水(使用前需要脱气)。2.2.10 苯+乙腊(98+2)，用于配制黄曲霉毒素BI、民、G1、马标准溶液。2.2. 11 苯十乙腊(9+1)，用于配制黄曲霉毒素M1标准榕液。2.2.12 次氯酸铀溶液(5%):用于浸泡器皿，去除黄曲霉毒素污染。2.2.13 黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2标准溶液及标准曲线(见附录D)。2.3 仪器设备使用实验室通用仪器设备，特殊情况说明如下:SN/T 1664-2005 2.
8、3. 1 一次性注射器:10mL和50mL。2.3.2 真空系统。2.3.3 离心机:能产生6600 r/min的转速。2.3.4 移液管:1. 0 mL、2.0mL和50.0mL。2.3.5 玻璃烧杯:250mL。2.3.6 容量瓶:100mL 2.3.7 水浴:能在300C:f: 20C , 50oC :f: 20C , 35 oC至370C之间温度段使用。2.3.8 滤纸。2.3.9 有刻度的锥形玻璃试管:带玻璃磨口的瓶颈和瓶塞，容量为5mL、10mL、20mL。2.3.10 高效液相色谱仪2.3.10.1 元脉冲泵:可以调节到恒体积流量为1mL/min。2.3.10.2 进样系统:具有
9、固定进样量。2.3.10.3 反相色谱柱:填充3m或者5m的十八屁基硅胶，加填充有反相材料的保护柱。2.3.10.4 荧光检测器:激发波长365nm、发射波长435nmo 2.3.10.5 记录仪z带打印机或标绘器、或者电子积分仪、或者计算机数据处理系统。2.3.11 分光光度计。2.3.12 天平。2.4 试样制备2.4. 1 牛奶将牛奶样品在水浴(2.3.7)中加热到350C370C。用滤纸(2.3.8)过滤，或者在6600 r/min的条件下离心15min，至少收集50mL的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。2.4.2 奶粉称取10g样品(精确到O.1 g)置于250mL的烧杯中
10、。将50mL己预热到500C的水每次少量地加入到奶粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果奶粉不能完全地榕解，将烧杯在500C的水浴(2.3.7)中加热30min，仔细棍匀。将牛奶乳浊液冷却至室温后，用少量的水将其全部转移到100mL的容量瓶(2.3.6)中，再用水稀释至刻度。用滤纸(2.3.8)过滤，或者在6600 r/min的条件下离心15mino至少收集50mL的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。2.4.3 免瘟亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒(2.3.1)与亲和柱(2.2. 1)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统连接起来(2.3.2)。2.4.4 样晶的提取、纯化与衍生用移液管移取
11、50mL的试样(2.4. 1或2.4. 2)到50mL的注射器筒(2.3. 1)中，使它们以2 mL/min3 mL/min稳定的流速通过亲和柱，流速可以通过真空系统控制(2.3.2)。取走50mL的注射器筒，并用干净的10mL注射器筒代替。然后用10mL的水进行清洗，水的流速应该保持稳定。清洗后，继续抽空气至亲和柱的下部完全干燥。使亲和柱与真空系统脱离后，将4mL乙睛(2.2.7)加入到10mL的注射器筒中将亲和柱上的黄曲霉毒素M1、Bl、Bz、G1、Gz洗脱下来。所有4mL乙睛通过亲和柱的时间至少需要60s，流速可以通过注射器的柱塞来控制。将洗脱液收集于锥形试管中(2.3.9)。将洗脱液同
12、系列标准曲线工作液一样在氮气流(2.2.6)中挥发近干(如果蒸发至完全干燥，则会造成黄曲霉毒素M1、Bl、岛、G1、G2的损失。)加入200L正己皖(2.2.2)和200L三氟乙酸(2.2.3)，在旋涡混匀器上混匀约5s10 s，让说合物在400C水浴(2.3.7)中放置10min，然后在氮气流(2.2.6)下再挥干，用0.5mL 10%乙睛榕液(2.2.9)恪解，并在旋涡?昆匀器上充分棍匀，供液相色谱用。SN/T 1664-2005 注:如果注入HPLC的含有黄曲霉毒素Mj的样品中乙脯含量超过10%，色谱峰变宽。如果水的含量超过90%，则对色谱峰的形状没有影响。2.5 高效液相色i普测定2.
13、5. 1 测定条件2. 5. 1. 1泵以恒定流速将流动相(2.2.8)通过HPLC柱。根据需要(根据所用色谱柱的型号)，调整HPLC流动相(2.2.8)中乙腊+异丙醇+水的比例，以保证使黄曲霉毒素MI，BI、Bz、G1、Gz与其他成分的分离效果最佳。流动相(2.2.8)的流速根据所用色谱柱(2.3.10.3)的型号不同而有所差异。对于普通CI8色谱柱(柱长约25cm、柱内径约4.6mm)而言，流速在1mL/min左右，效果最好;柱内径约3mm时，流速在0.5mL/min左右，效果最好。为了确定最佳的色谱条件，可以先将样品提取液(最好不含有黄曲霉毒素MI，BI、昆、G1、Gz)注入HPLC，然
14、后再注入提取液与黄曲霉毒素M1、BI、岛、G1、Gz标准溶液的混合液。2.5. 1. 2 色谱性能标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地对固定量的黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、Gz标准溶液进样，直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%。黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。过一段时间注入固定量的黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、Gz标准溶液，这些标准、溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。2.5.2 测定于HPLC注入适当体积的提取液(2.4.4)，应用的色谱条件与进样体积与测定标准曲线工
15、作液时一样，这时洗脱液中含有的黄曲霉毒素MI，BI、Bz、G1、Gz将会被分离出来。标准溶液和样品提取液的进样应该按照一定的顺序进行。当一系列样品提取液一个接一个地被进样时，建议每注入5个样品提取液后注入一个黄曲霉毒素M1 、BI、Bz、G1、Gz标准溶液。测定样品提取液衍生物的黄曲霉毒素M、BI、民、G1、Gz的峰面积或峰高，从标准曲线上查出注入的样品提取液中所含有的黄曲霉毒素M、BI、B2、G、Gz的质量数(ng)。如果样品提取液衍生物的黄曲霉毒素M1、B、Bz、G、Gz的峰面积或峰高比最大浓度的标准榕液的大或高，用10%乙睛溶液将样品提取液衍生物定量稀释，重新注入HPLC分析仪中。黄曲霉
16、毒素M、B、Bz、G、Gz衍生物的标准色谱图参见附录E。2.6 结果计算与表述2.6.1 牛奶2.6.1. 1 计算黄曲霉毒素M、B、8z、G、Gz的含量按(1)式计算:W m = mA X (VdV.) x (1 /V) 式中:Wm一黄曲霉毒素M、B、B2、G、G2的含量，单位为微克每升(g/L)。.( 1 ) mA-根据样品洗脱液衍生物的黄曲霉毒素的峰面积或峰高i从标准曲线上查得的黄曲霉毒素的质量数，单位为纳克(ng)。V广一样品洗脱液衍生物的最终体积数，单位为微升(L)。V i 注入样品洗脱液衍生物的体积数，单位为微升(L)。V一-通过亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升(mL)。3 SN
17、/T 1664一20052.6. 1. 2 测定结果的表示测定结果以g/L表示，精确到小数点后三位。2.6.2 奶粉2.6.2.1 计算黄曲霉毒素Mj、Bj、岛、Gj、岛的含量按(2)式计算:Wp = mA X (VdVJ x Cl /m) 式中zWp一-黄曲霉毒素Mj、Bj、Bz、Gj、Gz的含量，单位为微克每千克(g/kg)0 m一50mL样液(2.4.4)中所含有的奶粉质量数，单位为克(g)。mA，Vf、Vi的含义与2.6. 1. 1中所定义的一样。注2该公式仅适用于被测溶液没有稀释的情况，如在稀释条件下，则应该将稀释倍数计算进去。2.6.2.2 测定结果的表示测定结果以g/kg表示，精
18、确到小数点后两位。3 测定低限和回收率3. 1 测定低限本方法的测定低限:对奶粉的测定低限是0.08g/kg.对牛奶的测定低限是0.008g/L。3.2 回收率3.2. 1 对牛奶添加浓度和回收率的实验数据如下: ( 2 ) 在添加浓度为O.01g/L时，黄曲霉毒素Mj、Bj、Bz、Gj、岛的回收率分别为66.0%、73.4%、79.4%、95.3%、87.9%;在添加浓度为0.05g/L时，黄曲霉毒素Mj，Bj、民、Gj、G2的回收率分别为89.6%、76.2%、80.9%、92.1%、93.9%; 在添加浓度为O.1g/L时，黄曲霉毒素Mj、Bj、B2、Gj、Gz的回收率分别为96.9%、
19、76.7%、81. 8%、88.0%、80.6%。3.2.2 对奶粉添加浓度和回收率的实验数据如下:在添加浓度为O.1g/kg时，黄曲霉毒素Mj、Bj、民、Gj、G2的回收率分别为73.2%、79.2%、80.3%、97.0%、87.8%; 在添加浓度为0.5g/同时，黄曲霉毒素Mj、Bj、岛、Gj、G2的回收率分别为86.0%、85.2%、79.8%、84.0%、93.8%; 在添加浓度为1.0g/kg时，黄曲霉毒素Mj、Bj、Bz、Gj、马的回收率分别为89.5%、76.7%、78.3%、84.2%、77.6%。4 SN/T 1664一2005附录A(资料性附录)本标准章条编号与ISO14
20、501: 1998章条编号对照表人1给出了本标准章条编号与ISO14501: 1998章条编号对照一览表。表A.1本标准章条编号与ISO14501: 1998章条编号对照本标准章条编号对应的ISO14501: 1998章条编号warnmg 2 2 2. 1 3 2.2 4 2. 2. 22. 2. 5 ,2. 2. 8 ,2. 2.1O2. 2.12 4.4 2.2.13 4. 5 2.3 5 6 ,7 2.4 7.2 2.4.3 7.3 2.4.4 7.4 2. 5 7.5 2.5.1 2. 5. l. 1 7.5. 1 2. 5. l. 2 7.5.2 2.5.2 7.5.4 2. 6 8
21、 3 9,10 附录C4. l. 1 ,4. l. 2 附录以14.5.1 附录0.24.5.2 附录0.34. 5. 3 附录0.47.5.3 附录E附录A附录BAnnex A 5 SNjT 1664-2005 附录B(资料性附录)本标准与ISO14501: 1998技术性差异及其原因表B.1给出了本标准与ISO14501 :1998的技术性差异及其原因的一览表。表B.1本标准与ISO14501: 1998的技术性差异及其原因本标准的章条编号技术性差异原因将测定范围扩大为黄曲霉毒素M1、Bl、Bz、经过本标准验证(具体数据请参见第3章回收1 率该免疫亲和柱也可以用于吸附和净化B1、G1、G2
22、082、G1，G2o增加了2.2.2，2.2.3、2.2.4，2.2.5而去掉了1)由于标准溶液校准方法及流动相改变，需要2.2 这些试剂。三氯甲烧。2)三氯甲烧是大气中臭氧消耗剂。原方法的流动相乙腊-水(25十75)改为乙膀-参考AOAC公定分析方法986.16B. (d)及E.2.2.8 异丙醇-水(8+12+80)。改变流动相。2. 2. 10及2.2.11把黄曲霉毒素的溶剂由三氯甲烧改为苯，M1、Bl、岛、G1、G2标准溶液标定，参考乙腾。AOAC97 1. 22A、B.其溶剂为苯-乙睛。附录D标准溶液的溶剂及校准方法改变。标准溶液囱M1又增加了凯、B2、G1、G2故参考AOAC971
23、.22A、B对标准溶液进行标定。1) MB，、岛、G】、G2经衍生后检测灵敏度2.4.4及D.4增加了衍生化步骤。提高。2)定容体积更容易准确掌握。1)增加了测定低限和回收率。1)根据SN/T0001-1995的要求增加。3 2)将原来9精密度、10试验报告去掉。2) SN/T 0001-1995无要求。6 SNjT 1664-2005 附录C(规范性附录)柱效检查及回收率检查C.1 柱效检查用移液管(2.3.4)移取1.0 mL的黄曲霉毒素矶、B、马、G、Gz储备液(D.2)到20mL的锥形试管中(2.3.9)。用恒流的氮气(2.2.6)将液体慢慢吹干，然后用10mL 10%乙睛(2.2.9
24、)溶解干基质，用力摇荡。将该溶液加入到40mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明使用亲和柱。淋洗亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素M、BI、B2、G、马，将洗脱液进行适当稀释后，用HPLC测定亲和柱键合的黄曲霉毒素MI，BI、B2、G1、马的含量。计算黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、马的回收率，将其结果与2.2.1中所要求的指标进行对比。C.2 回收率检查用移液管(2.3.4)移取0.8mL 0.005g/mL的黄曲霉毒素M1、B1、昆、G1、G2标准工作液(D.3)到10 mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明使用亲和柱。淋洗亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素M1、BI、岛、G1、G2，将
25、洗脱掖进行适当稀释后，用HPLC测定亲和柱键合的黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、马的含量。计算黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2的回收率，将其结果与2.2. 1中所要求的指标进行对比。7 SN/T 1664-2005 D.1 标准溶液的标定附录D(规范性附录)标准溶液黄曲霉毒素Mz、Bz、Bz、Gz、Gz标准溶液浓度约为10g/mL溶液浓度的标定如下:用分光光度计在最大吸收处(接近350nm)测定校准溶液苯十乙睛(98+2)对黄曲霉毒素M1是苯十乙腊(9十1)J的腰光值作为背景，然后在最大吸收波长处测定黄曲霉毒素溶液的A值，按式(D.1)计算黄曲霉毒素溶液的浓度(CAFT): CAF寸=
26、A X MX 1000/AFT .( D.1 ) 式中zA一-黄曲霉毒素标准潜液在最大吸收波长处的吸光值;M一-摩尔质量数值(Mz:328 g/mol、B1:312 g/mol、B2:314 g/mol、Gz:328 g/mol、Gz:330 g/mol); AFT一一黄曲霉毒素Bz、B2、Gz、G2在苯+乙腊(98+2) 其中黄曲霉毒素Mz采用苯十乙腊(9+1)J的摩尔吸光因子值(Mz18 815 m2/mol、Bz19 800 m2/mol、B220 900 m2 / mol、Gz17 100 m2/mol、G2 18 200 m2/moD。注:见AOAC97 1. 22 A、B.15版.
27、北京.1990.1319，D.2 标准储备液确定标准溶液的实际浓度值后(见D.1)，继续用苯十乙睛(9+1)(2.2.11)将各标准榕液稀释至被度为o.1g/mL的储备液。储备液应盖好盖，用铝筒包装好避光保存。将储备液放在冰箱中50C以下保存。在这种情况下，储备液可以稳定2个月。2个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。D.3 黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2标准工作液从冰箱中取出储备液(D.2)放置至室温，然后移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液宜现配现用。黄曲霉毒素Mz、Bz、B2、Gz、G2标准工作液配制:分别用移液管(2.3.4)各移取1.0 mL的标准储备液(D.2)到
28、20mL的锥形试管(2.3.的中，用恒流的氮气(2.2.6)将液体缓慢吹干，然后用20.0mL 10%的乙睛(2.2.9)将残留基质重新溶解，间歇振摇30min、充分氓匀，配成浓度为0.005/1g/mL黄曲霉毒素Ml，Bz、岛、G1、G2标准工作液。在用氮气对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，不能让温度降得太低，防止凝聚产生。D.4 黄曲葛毒素M1、矶、B2、G1、G2的标准曲线在做标准曲线时，黄曲霉毒素Mz、B1、岛、G、G2的进样量水平分别为O.05 ng、0.1ng、0.2ng和0.4吨。根据HPLC进样环的容积量，用标准工作液配制成0.5mL适当浓度的黄曲霉毒素M1、B1、岛、G、
29、G2系列标准曲线工作液。将系列标准曲线工作液在氮气流中挥发近干，加入200L正己烧和200L三氟乙酸，在旋涡混匀器上混匀约5slO日，让混合物在40C水浴中放置10min，然后在氮气流下再挥干用O.5mLIO%乙腊熔掖溶解，并在旋涡混匀器上充分泪匀，衍生物供液相色谱测定。注z衍生过程见AOAC982. 26 E.15版-北京.1990.1341，由峰面积或峰高对黄曲霉毒素M1、B1、民、G、G2质量数绘制成标准曲线图。8 SN/T 1664-2005 附录(资料性附录)黄曲葛毒素的标准色i曹固E %F N臼E-O冈山.由NOhHdTh.的HmCC.mHOLJ飞-HLF凹.N同宠E的-H9 8
30、7 6 。由.一【5 4 3 2 9 黄曲葛毒素M1、B1、B2、G1、G2衍生物的标准色谱圄5 1 0 固E.1SN/T 1664-2005 参考文献lJ国家商检局AOAC编译委员会.美国公职分析化学家协会公定分析方法.1990年第15版.北京.中国科学技术出版社.1991年.134110 SN/T 1664-2005 Foreword The revision of this standard adopts 150 14501 : 1998. Milk and milk powder-Determination of af la toxin M, content-Clean-up by i
31、mmunoaffinity chromatography and determination byhigh-perform ance liquid chromatography. This standard is redrafted in accordance with 150 14501: 1998. Convenient for compare , The Annex ACstandardization) lists a table of item comparison between this standard and 150: 14501: 1998 for the cause of
32、convenience of comparison. 5ince the capability of immunoaffinity column had been tested and its applicability expanded , modifi cation has been made in this standard when adopting the international standard. The difference of technology Vl(as indicated with vertical line at margin of the relevant i
33、tems. In annex B the technolog ical difference and causation with this standard regard to 150:14501 :1998 were Given. Annexes C、Dof this standard are informative annexes , Annexes A、B、Eof this standard are standard izatlon annexes. Other modification in redaction has been made in this standard for c
34、onvenience: a) this international standard has been changed into this standard. b) , regarded for decimal point has been replaced with . . c) The foreword , annex and bibliographof international standard has been deleted. This standard is proposed and is under the charged of the Certification and Ac
35、creditation committee of the People s Republic of China. 丁hisstandard was drafted by Ningbo Entry-Exit Inspection and Ouarantine Bureau of the People s Republic of China. The principal drafters of this standard are Li Zuoqing Kang Jitao Sun Dawei Zhang zaiting Xie Dong hua and Yu Xuejun. This standa
36、rd is the first special normal standard of the Entry-Exit Inspection and Ouarantine of the Peoples Republic of China. 11 SN/T 1664-2005 Determination of af1atoxin M1 ,B1 ,BhG1and G2Content in milk and milk powder 1 Scope This Standard specifies the method for determination of aflatoxin M, ，息，也，G, an
37、d G2 content in milk and milk powder cleaning-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-per formance liquid chromatography. This Standard is applicable to the determination of aflatoxin M, ，凯，也，也and G2 content in milk and milk powder. It is also applicable to low fat milk, skimme
38、d milk, low fat milk powder and skimmed milk powder. The lowest level of validation is O. 08g/kg for whole milk powder i. e. O. 008g/L for reconstituted liquid milk. 2 Method for determination 2. 1 Principle Aflatoxin M 8, ，民，G, and G2 is extracted by passing the test portion through an immunoaffini
39、ty column. The column contains specific antibodies bound onto a solid support material. As the sample passes thr,ugh the column , the antibodies selectively bind with any aflatoxin M, ，息，岛，G, and G2 (antigen) present and form an antibody-antigen complex. AII other components of the sample matrix are
40、 washed off the column with water. Then aflatoxin M, ，息，也，G, and G2 is eluted from the col umn and the eluate is collected. The amount of aflatoxin M, ，息，也，也andG2 present in this eluate is determined by means of high-performance liquid chromatograph(HPLC) coupled with fluorimetric detection. 2. 2 Re
41、agents and materials Use only reagents of recognized analytical grade , unless otherwise specified , and distilled or demi neralized water or water of equivalent purity. 2.2. 1 Immunoaffinity column: The immunoaffinity column shall contain antibodies against aflatoxin Ml息，也，也andG2 The column shall h
42、ave a maximum capacity of not less than 100 ng of aflatoxin M队，也，也and G2 (which corresponds to 2g/L when a volume of 50 mL of test portion is ap plied) ,and shall give a recove叩ofnot less than 80% for aflatoxin M, ，息，鸟，也，G2 when a stand-12 SN/T 1664-2005 ard solution containing 4 ng of toxin is appl
43、ied (which corresponds to 80 ng/L when a volume of 50 mL of sample is applied ). Animmunoaffinity column meeting the performance specifications men tioned above can be used. The performance of the columns shall be checked regularly and at least once for every batch of columns(see annex C). 2. 2. 2 n
44、-Hexane. 2.2.3 Trifluoroacetic acid(99%). 2. 2. 4 iso-propanol. 2. 2. 5 8enzene. 2.2. 6 Nitrogen gas . 2.2.7 Acetonitrile of HPLC grade . 2.2.8 Acetonitrile + iso - propanol + water (8 + 12 + 80) , mobile phase (degas before use). 2.2.9 10% Acetonitrile solution: Add 10 mL of Acetonitrile (4.7) to 9
45、0 mL of water(degas before use). 2.2.10 8enzene + Acetonitrile(98 + 2) , to be used to confect aflatoxin 8, , 82, G, and G2 standard solution. 2.2. 11 8enzene + Acetonitrile(9 + 1) ,to be used to confect aflatoxin M, standard solution. 2.2.12 Sodium hypochlotite solution(5%) , used to soak the aflat
46、oxins pollution out of vessel. 2.2.13 Aflatoxin M, ，息，82，G忖G2standard solutions and standard curve: see annex D. 2. 3 Apparatus Usual laboratory equipment and , in particular ,the following. 2.3.1 Disposable syringes , of capacities 10 mL and 50 mL. 2.3.2 Vacuum system( e. g. 8uchner flask , Vac-Elu
47、te system ) or peristaltic pump. 2.3.3 Centrifuge, capable of producing a rotate speed of 6 600 r/min. 2.3.4 Pipettes , of capacities 1.0 mL. 2. 0 mL and 50.0 mL. 2.3.5 Glass beakers , of capacit250 mL. 2.3.6 Volumetric flask , of capacity 100 mL. 2.3.7 Water baths , capable of operating at 300C :t
48、20C , 500C土20C,and between a5 oC and 3rC. 2.3.8 Filter paper 2.3.9 Graduated conical glass tubes , with ground glass neck and stopper, of capacities of 5 mL , 10 mL. and 20 mL. 2.3.10 LC-equipment 2.3.10.1 Pulse-free pump , suitable for constant volume flow rate of about 1 mL/min. 2.3.10.2 Injector
49、system , with fixed or variable injection volume loop. 2.3. 10.3 Reversed-phase HPLC analytical column , with 3m or 5m packing of octadecyl silica gel plus guard column filled with reverse-phase material. 2.3.10.4 Fluorescence detector, excitation wavelengths 365 nm and emission Wavelengths 435 nm. 2.3.10.5 Strip chart recorder , with aprinter or plotter,or electronic
