1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/1678-2005 梨形虫病病原鉴定方法Protocol of agent identification for piroplasmosis 2005心任30发布2006心5皿01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局。币。只m:J000062SN/T 1678-2005 前言本标准参考了OI日陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)2004版的2.3.8.2.3.9和2.5.6章。本标准的附录A为规范性附录，附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本
2、标准主要起草人:高志强、张鹤晓、谷强、郭晋优。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。梨形虫病病原鉴定方法1 范围本标准规定了牛、羊、马及犬的梨形虫病病原鉴定方法。本标准适用于牛、羊、马及犬的梨形虫病病原检阅与鉴定。2 器械与试荆2. 1 试剂EDTA洛液(1mg/mL) (见附录A): 一-5%与10%的姬姆萨染液(见附录A);甲晖(分析纯)。2.2 器械光学显微镜(8倍以上自镜和60倍以上物镜); 一一目镜前j微计;台测微计;号mL注射器，20号针头;一一载玻片。3 样品的采集SN/T 1678-2005 3.1 活动物:从尾尖或耳尖部采血，制作血涂片;也可无菌采集颈静脉血于抗凝剂EDT
3、A溶液中(1 rng/mL)。3.2 病死动物:采样时死亡时间不超过24九采集样品包括来自蹄菇、耳朵及尾尖的外周血以及大脑皮层、肾、肝和骨髓等脏器(按重要性排序)。采集的样品于低温条件下(5C左右)迅速送达实验室。3.3 泰勒虫病采样:除采血外，还需穿刺淋巴结进行涂片。4 操作方法4. 1 涂片制作及固定4. 1. 1 薄血膜的制作在洁净玻片近左端滴1滴血液，用推片沾取少囊血液，从载片近右端处涂一薄的血膜，空气干燥后，用甲薛固定1min，再用10%姬姆萨染液染色20min30 min，剧涂好的血片应尽快染色，以确保良好的染色质量。4. 1. 2 厚血膜的制作于洁净的载玻片上滴1小滴血液(约50
4、L)，风染色20rnin30 min。4. 1. 3 脏器涂片的制作80C加热固定5min，然后用5%姬姆萨染液用l块洁净的玻片轻触脏器的新鲜切面，或者以2块洁净的玻片轻轻夹住1小块组织，纵向推压玻片，使两政片都留下l层组织。待涂片风干后，用甲醇由定5min，再用10%姬姆萨染液染色20min 30 rnin。4.1.4 淋巴液涂片的制作将用注射器抽取的淋巴液推至载玻片上，再用针头抹开，制成涂片。待涂片风干后，用甲醇固定SN/T 1678-2005 5 min，再用10%姬姆萨染液染色20miw飞-30mino 4. 1. 5 血溜浓集检查取一离心管，加入抗凝血6mL7 mL，充分混合，500
5、r/min离心5min。用吸管吸取接近红细胞层的黄色血浆2mL3 mL到另个离心管中，以2000r/min的速度离心40min，弃去上层液体，用沉淀制各涂片，风干后800C加热回走5min，然后用5%姬姆萨染液染色20min，户句、气、.乌白4.2 涂片虫体大小的显微测量使用自镜测微计和镜台测微计进行虫体大小的显微测埠。4.3 染色涂片虫体的镜检用8倍以上自镜和60倍以上物镜，在油漫下检查染色涂片。先用低倍镜对血膜整体观察一下，梨形虫具有明晰而纤细的轮廓，有淡蓝色的浆和红紫色的染色质。镜检时，观察一个红细胞内的虫数，虫体在红细胞内的位置，虫体的大小、形态、染色质块的数目，同时观察红细胞染虫蔡的
6、高低。至少观察100个视野。5 判定5. 1 牛、羊及犬巴贝斯虫5. 1. 1 感染牛的目贝斯虫:形态团参见第C.1章。5. 1. 1. 1 牛巴贝斯虫:该虫虫体较小，通常位于红细脂中央，长约1m1.5m，宽O.5ml.Om， 虫体成对出现，且一端相连成钝角。5. 1. 1. 2 分歧旧贝斯虫:虫体也较小，在形态上与牛巴贝斯虫非常类似，所不同的是成钝角相连的成对虫体常位于红细胞边缘。5. 1. 1. 3 双芽巴贝斯虫:虫体较长，长约3m3.5m，宽1m1.5m，成对虫体往往呈锐角相连，各有2个不相连的红染点(陌牛巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫往往只有1个红染点)。卵形巴贝斯虫为大型虫体。虫体成典型的梨
7、形，但也有形状各异的单个虫体存在。5. 1. 2 感染羊的巴贝斯虫:形态团参见第C.2章。感染羊的巴贝斯虫主要为莫氏巴贝斯虫，该虫为大型虫体，虫体呈圆形或梨形。5. 1. 3 感染犬的巴贝斯虫:形态阁参见第C.3章。犬的吉氏巴贝斯虫虫体很小.长度一般为1m-2.5m，多位于红细胞边缘或偏中央，呈梨形、环形、椭圃形、圆形、小杆形等多种形态。5.2 牛、羊泰勒虫形态因参见附录D，裂殖体的形状与大小不一，着染成浅蓝色或蓝色，其中含有浅红色或深紫色的染色质核，裂殖体多位于淋巴母细胞和单核细胞的胞浆内，有时在细胞外圈也可看到。裂殖体有两种，一种含有150个核，核大.单个核的大小平均为1I日，轮廓不大清楚
8、;另一种梨殖体，核数可达200个，较小，平均大小为0.22m，轮廓清楚，为圆形，深紫色。山羊泰勒虫形态与牛环形泰勒虫相似.有环形、椭圆形、短杆形、逗点形、钉子形、圆点形等各种形态，其中以自形最为多见。圆形虫体直径为O.6m1.6mo一个红细胞内一般只有一个虫体，有时可见到2个3个，红细胞染虫率O.5%30%，最高达90%以上。裂殖体的形态与牛环形泰勒虫相似.可在淋巴结、脾、肝等的涂片中查到。5.3 马梨形虫形态因参见附录E。5.3. 1 马巴贝斯虫:裂耀子相对较小，长度小于2m3m，一般不超过红细胞的半径，呈圆形或阿米巴样，通常4个裂殖子在一起，形成四联体或马尔他十字排列。5.3.2 驾巴贝斯
9、虫:红细胞内的裂殖子是梨状.长2m5m，一般大于红细胞半径，直径1.33.0m。其特征是成对裂殖子的后端相连。A.1 1 mg/mL览。TA溶液的配制附录A(规范性附录)溶液配方SN/T 1678-2005 准确称取1.1g工水乙二股四乙酸二铀(EDTA-Na2.HzO)，加入800rnL生理盐水中，置55C60C水洛中溶解，冷却后用生理盐水定容至1L，121C土3C灭菌15rnin。A.2 姬姆萨染溜的配制取姬姆萨染料0.6g，加入50rnL甘油中，置55C60C水?谷中1.5h2h后，加入甲醇50rnL.静置1d以上，滤过即成姬姆萨染色液原蔽。染色前，用蒸憧水配制成所需浓度。应当注意，所用
10、蒸锚水必须为中性或微碱性，若蒸馆水偏酸.可于每10rnL左右加入1%嵌酸锦溶液1滴，使其变成微破性。3 SN/T 1678-2005 附策B(资料性附录)梨形虫的分类特征梨形虫病是由顶复门(ApicornplexaLevine)梨形虫纲(Piroplasrnea)梨形虫自(PiroplasrnidaWe nyon)巴贝斯科CBabesiidae)曰贝斯属(Babesia)及泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)中不同病原引起的多种动物疾病的统称。梨形虫是梨形、圈形、杆状或阅米巳样。主要寄生于红细胞，有时也寄生于其他细胞，在脊椎动物宿主体内进行裂殖生殖，在无脊椎动物宿主内
11、进行抱子生撞。传播媒介为硬蝉。发育须以哺乳动物为中间宿主，蝉为终末宿宝。具有典型的子包子虫三阶段生活史，裂殖生殖在哺乳动物体内进行。目贝斯虫的种类较多，分别感染牛、马、羊、犬等.可造成重大经济损失。牛的巴贝斯虫钮括牛巴贝斯虫(B.bovs)，双芽巴贝斯虫(B.bgemina)、分歧巴贝斯虫(.divergens)和卵形巴贝斯虫(B.ovata)。寄生于羊的巴贝斯虫为莫氏巴贝斯虫(且motas)。寄生于犬的虫种为犬巴贝斯虫(B. canis)和吉氏巴贝斯虫(B.gibson仆，吉氏巴贝斯虫为主要致病虫种。马的巴贝斯虫包括马巴贝斯虫(B.equi)和驾巴贝斯虫(.balli)。巴贝斯虫寄生于哺乳动
12、物(牛、羊、马、犬等)的红细胞内，在巴贝斯虫的生活周期中.裂殖子侵入红细胞，并在其中转变成滋养体。滋养体生长分裂成2个卵圄形或梨状裂殖子，成熟的裂殖子又能感染新的红细胞.重复这样的分裂过程。泰勒虫主要感染牛和羊，其中感染牛的泰勒虫包括小泰勒虫(丁.arva)、环形泰勒虫(T.annula ta)、突变泰勒虫CT. mutans)、哺乳泰勒虫(T.taurotragi)、缘膜泰勒虫(T.velifera)、瑟氏泰勒虫(T. sergenti)、东方泰勒虫(T.orientalis)及水牛泰勒虫(T.buffeli)。羊的泰勒虫有两种，即山羊泰勒虫(丁.hirc巾i)和绵羊泰勒虫(T.ovis)
13、，其中山羊泰勒虫为羊主要的致病虫种。泰勒虫的裂殖生殖在淋巴细胞、组织细胞、成红细胞或其他细胞里.后侵入红细胞，红细胞内虫体不分裂。裂殖生璋的裂殖体出现于牌、淋巴结等处的淋巴细胞内或游离于细胞外，称为相赫氏体(kochs body，即裂殖体)，内含有许多小的裂殖子或染色质颗粒。与巴贝斯虫所不间的是，裂殖生殖时不进入红细胞，而是进入淋巴细胞、应噬细胞等中进行裂殖生殖，形成树赫氏体，反复多次分裂后进入红细跑内形成配子体，不再分裂。4 SN/T 1678-2005 附录C(资料性附录)牛、羊及犬巴贝斯虫形态图C.1 感染牛的巴贝斯虫图C.1红细胞内的牛臼贝斯虫自C.2红细胞内的双芽凹贝斯虫C. 2 感
14、染羊的巴贝斯虫图C.3红细胞内的莫氏巴贝斯虫C.3 感染犬的巴贝斯虫图C.4红细胞内的吉氏巴贝斯虫D SN/T 1678一2005附录D(资料性附录)牛、学的泰勒虫形态圈图D.1红细胞内的环形泰勒虫圈。.2环形泰勒虫裂踵体6 二百b1:-. _(:;! 飞、. 平、，毛附录E(资料性附录)马的梨形虫形态图图E.1红细胞内的马巴贝斯虫因E.2红细胞内的驾巴贝斯虫SN/T 1678-2005 BON-hSH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准梨形虫病病原鉴定方法S0I fT 1678-2005 击毛中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷1/1 6 印张O.75 字数14千字版2006年1月第一次印刷印数12000开本880X 1230 2006年1月定价8.00元主书号:155066 2-16602 SN/T 1678-2005
