1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1705一2006出入境口岸森林脑炎检验规程Examination codes for tick-borne encephalitis at entry-exit port 2006-01-26发布060, 12000102 2006-08-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局前昌本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林省职业病医院。本标准主要起草人:杨怀宁、冯华、王勇、董思祀、赵大力、刘金华、浦肉。本标准为首次发布的出入境检
2、验检疫行业标准。SN/T 1705-2006 I SN/T 1705-2006 出入境口岸森林脑炎检验规程1 范围本标准规定了入出;Q扉囊栋靡炎前撞验方法、结果报告、阳性结果处置。本标准适用于入出随口岸的森林脑炎幢验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为在条款dZ日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适俑于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是茶注日期的引用X轩，其最新版本适用于本标准。GB 19489实验室生物安通商要求3 术语和定义下列术语和定义适3.1 森林脑炎tick-bo 又称苏联春夏脑炎如础也
3、是由蠢蠢翩童翩翩蛐盘陆经硬蝉叮咬所致自然疫摞性急性中枢神经系统传染病。临床特征是突发高热、意识障碍，头痛、项强、上肢与颈部及肩脚肌瘫痪，后遗症多见。4 标本处理4.2 蝉标本采集的蝉先冰冻，中，每个成虫置于5006块，若虫切成2块有样品的试管经涡轮冰浴井离心，取上清作5 准备6 实验室检验方法6. 1 间接免擅荧光检验按商品化试剂盒的说明书操作，下面以欧蒙抗TBE抗体CIgG，lgM)间接免疫荧光法检测试剂盒1)为例。1) 该试剂盒是由欧蒙(德国医学实验诊断股份有限公司提供的产品商品名，是适合市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。1 SN/T 1705
4、-2006 6. 1. 1 准备6. 1. 1. 1 检验IgG类抗体:待测标本用样品缓冲液1: 10稀释。例如:取11.1L样品用100L样品缓冲液稀释并充分混匀。6. 1. 1.2 检验IgM类抗体z检验特异性的IgM抗体前，应除去血清中的IgG型的抗体，可以用超速离心，层析或免疫吸附的方法进行。待测标本用欧蒙吸附剂以1: 10稀释(如:在100L欧蒙吸附剂中加入11.1L血清，充分氓匀，旋涡混匀器振荡4s)。室温温育15min后离心。min，2000 r/min)。6. 1.2 加样将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25L稀释后血清至加样板的每一反应区，避免产生气泡。加完所有待测标本后
5、再开始温育(最多200份)。6. 1. 3 温宵将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每-样品均与生物薄片接触且样品间互不接触。室温(18.C25.C)温育30日un.6. 1. 4 冲洗用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载片1s，然后立即将其摄入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中漫泡至少5mtn。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡。6. 1. 5 加样滴加20LFITC标记的抗人IgG或IgM(荧光二抗)至洁净加样板的反应区，完全加完所有的荧光二抚方可进行下一步温育。建议使用连续加样器。FITC标记的抚人IgG或IgM使用前需棍匀。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加二
6、抗至另一个加样板的反应区。6.1.6 温育从洗杯中取出一张载片，5s内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里。注意t为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张。室温(180C 25 OC)温育30min，注意避免阳光直射载片。6.1.7 冲洗用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载片S，然后立即将其漫入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸洗至少5min。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡。可在每150mL PBS吐温缓冲液中加10滴伊文斯蓝作为衬染。6. 1. 8 封片将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里n滴加甘油PBS至盖玻片:每一反应区约10L。从PBS
7、吐温缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和边缘的水分，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌人到载片的凹槽里。6. 1.9 结果判定显微镜下观察荧光模型。阳性对照模型:抗TBE病毒抗体在感染细胞的细胞浆中表现特异性荧光模型，而细胞核为阴性。成群的感染细胞根据其感染程度不同，荧光模型表现为清晰的粗滴状到网状结构，部分未感染的细胞没有荧光。如果血清中存在抗TBE病毒抗体，其荧光模型与阳性对照模型相同。如果所有细胞的细胞核或细胞浆被染色，可能存在抗核抗体或抗线粒体抗体及其他的细胞抗原。如果阳性对照没有出现特异性的荧光模型或阴性对照出现清
8、楚的特异性荧光模型，则说明实验结果不可靠，实验应重做。6.2 ELISA检验按商品化试剂盒的说明书操作，下面以欧蒙抗TBE抗体(lgG，lgM)ELISA检测试剂盒2)为例。6.2.1 准备2 将待测标本用样品缓冲液1: 101稀释。例如:取10L血清用1mL样品缓冲液稀释并充分棍2) 该试剂盒是由欧蒙(德国)医学实验诊断股份有限公司提供的产品商品名，是适合市售产品的实例，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。SN/T 1705-2006 匀。检验特异性的IgM抗体前，应除去病人血清中的IgG型的抗体，可以用超速离心，层析或免疫吸附的方法进行。6.2.2 标本温育向相应
9、微孔分别加标准血清、阳性对照，阴性对照和稀释后血清各100L，室温(180C 25 OC)温育30 min 。6.2.3 清洗倒掉微孔板内液体，用稀释后的清洗缓冲液洗三次，每次300L。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30s，然后再倒掉。清洗后，应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。6.2.4 酶结合物温育滴加100L酶结合物至每一微孔，室温(180C250C)温育30mino 6.2.5 清洗倒掉微孔板内液体，如上述步骤清洗。6.2.6 底物温育滴加10OL色原/底物液至每一微孔，室温(180C2刽50C)避光温育1町5min 6.2.7 终止反应以与加色原/底物液时相同的速度和
10、顺序滴加100L终止液至每一微孔。6.2.8 比色450 nm比色，参考波长620nm650 nm，加完终止液后30min之内比色。比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。6.2.9 结果判定半定量公式:比值=对照或血清标本的吸光度值/标准品的吸光度值比值0.8为阴性，0.8比值1.1为可疑阳性，比值二三1.1为阳性。对于可疑阳性标本，建议7d后重新取样并与第一次实验标本平行进行检验，方可正确评价抗体滴度变化。6.3 蝉标本RT-PCR检验检验方法参见附录B。7 生物安全措施森林脑炎实验室生物安全见GB19489对生物安全2级(BSL-2)实验室的生物安全要求。8 检验结果报告8. 1 间接免
11、症荧光检验报告8. 1. 1 检验结果为阴性，报告森林脑炎病毒抗体阴性，并注明检验方法。8. 1. 2 检验结果为阳性，报告森林脑炎病毒抗体阳性，并注明检验方法。8.2 ELISA检验报告8.2.1 检验结果为阴性，报告森林脑炎病毒抗体阴性，并注明检验方法。8.2.2 检验结果为阳性，报告森林脑炎病毒抗体阳性，并注明检验方法。8.3 RT-PCR检验报告8.3. 1 检验结果为阴性，报告未检出森林脑炎病毒特异性Hyprstrain polyprotein基因，并注明检验方法。8.3.2 检验结果为阳性，报告检出森林脑炎病毒特异性Hyprstrain polyprotein基因，并注明检验方法。
12、9 阳性结果的处置对相应标本应送上级实验室(或指定的实验室)做复检或鉴定。阳性结果应在24h内向上级主管部门及发病地的卫生行政机关报告。3 SN/T 1705-2006 A.1 常用设备、器材用于森林脑炎检验一一Eppendorf管;二一微量加样器(0一一低温冰箱;一-370C水浴恒温箱;一一普通离心机;一一低温超速离心机;一一超低温冰箱;荧光显微镜;一一电泳仪;一一紫外灯;一一酶联免疫测定一一洗板机;一一-PCR扩增仪;一一手术刀片;一一-涡旋混匀器;一一试管。A.2 免疫荧光检验材料、一一样品稀释液;PBS盐，pH7.2吐温20;一一封片介质;一一吸附剂。A. 3 ELlSA检验材料、试剂
13、用于ELISA检验材料、试剂有:附录A(规范性附录)森林脑炎检验常用器材及试荆一一微孔板，包被有抗原的微孔:12条，每条有8个可分离微孔;标准品(lgM或IgG，人); 4 森林脑炎(TBE)病毒感染一一阳性对照(1gM或IgG，人); 一二阴性对照(lgM或IgG，人); 一一-酶结合物，过氧化物酶标记的抗人IgM或IgG(羊); 一一标本缓冲液，C检验IgM的缓冲液含IgG/RF吸附剂); 一一清洗缓冲液;一一色原/底物液，TMB/H202; 一一终止液，0.5mol/L硫酸。A.4 RT-PCR检验试剂用于RT-PCR检验试剂一-ChelexlOO树脂;一一TE缓冲液;一-Trizol试
14、剂;一一三氯甲烧;一一异丙醇;75%乙醇;一一-DEPC-J.)(; 一-OligoCdT)0.05g/一一5X逆转录酶缓冲液一一-RNasin(40U/ mL); 一一-dNTPs(10mmol/L) 一一逆转录酶(200U/.uL); 一一10XPCR缓冲液(含氧化镖); 一一-4dNTPsClOmmol/L); 一一上游引物(10mol/L); 一一下游引物(10mol/L); 一一琼脂糖;一一澳化乙链;一-TaqDNA聚合酶;一一-DNAmarker; 一一-电泳上样缓冲液。SN/T 1705-2006 5 SN/T 1705一2006附录B(资料性附录)蝉标本RT-PCR检验B. 1
15、 Trizol试剂提取总RNAB. 1. 1 取1.5 mL Eppendorf管，加入600LTriwl裂解液，加入200L蝉上清液，再加入200/-lL三氯甲皖上下颠倒混匀，于40C、12000 r/min离心15min。B. 1.2 吸取上清液转入一新1.5 mL Eppendorf管中，加入500L异丙醇(-200C预冷)，不要吸入中间层，颠倒均匀。B. 1.3 于40C、12000 r/min离心15mm，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600L75%的乙醇，颠倒洗涤。B. 1. 4 12 000 r/min离心10min，小心倒去上清液，4000 r/mm离心10s，
16、将管壁上残余的液体甩到管底部，用微量加样器吸干(吸头不要碰有沉淀的一面)，室温干燥。B. 1.5 加入20LDEPC水，轻轻混匀，、溶解管壁上的RNA，2000 r/mm离心5i，4C保存备用。提取的RNA应在2h内扩增，若长期保存须放置一70C冰箱。B.2 逆转录反应(RT)B.2.1 在总RNA沉淀中加入:Ohgo(dT)0.05g/mL DEPC水1L 9L 混合后置65C水浴10min，冰浴2mm B.2.2 向上述榕液中加入下列试剂:5X逆转录酶缓冲液RNasm(40 U/mL) dNTPs( 10 mmol/L) 逆转录酶(200U/-lL) DEPC-水1昆合后置37C水陆1h。
17、4.0L O. 25L 4.0L O. 5L 11. 25L B.2.3 将上述反应液移入68C水浴10minC灭活逆转录酶)或直接-20C保存备用。B.3 聚合酶链式反应CPCR)B. 3.1 引物下列一对引物是根据森林脑炎病毒(TBEV)基因的一段设计，具有高度特异性，可作使用时参考。阳性标本可扩增出175bp的片段。上游引物:5 -GCGTTTGCTC C , T) CGGA-3 下游引物:5-CTCTTTCGACACTCGTCGAGG-3B. 3. 2 扩增取PCR管编号，参照以下加样量加样z模板1L 10XPCR缓冲液(含氯化镜)5L 4dNTPs(10 mmol/U 2L 6 上游
18、引物(10mol汀，)下游引物(10mol/U1L 1L TaqDNA聚合酶(2U/L) 0.5L DEPC-7( 39.5L 充分氓匀后，在离心机上将管内液体甩入管底。SN/T 1705-2006 进行PCR扩增，反应条件:940C/5min，然后940C/30s , 550C/30 s ,7ZoC/l min，35个循环，最后720C /5 min 。B. 3. 3 电泳检验扩增结束后在管中加入上样缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶(含O.5g/mL澳化乙链)电泳，紫外灯下观察结果。B. 3. 4 结果判定如阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小为
19、175bp)，则可初步判定该样品中含有TBE病毒，应进一步进行确证试验;如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则可判断待测样品中不含有该病毒。B.3.5 测序若有条件可将PCR扩增产物在测序仪上进行测序，与已发表的TBE病毒序列进行比对，判断样品是否为TBEV。CON-mohFHZm 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出入境口岸森林脑炎检验规程SN/T 1705-2006 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷4峰1/16 印张O.75 字数14千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1一2000晤书号:155066.2-16761 7G 定价8.00开本880X1230 SN/T 1705-2006
