1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1718-2006 出入境口岸回归热检验规程Examination codes of relapsing fever at entry-exit port 2006-01-26发布060712000090 2006-08皿16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 -目U1=1 本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C、附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:初月、古莉冰、朱玉兰、孙颖、张树平、徐援。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。S
2、N/T 1718-2006 I 出入境口岸回归热检验规程1 范围本标准规定了入出境口岸回归热的检验对象、方法、结果报告、阳性结果处置。本标准适用于入出境口岸的回归热检验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 回归热relapsing fever 由疏螺旋体引起，以节肢动物为媒介传播的急性传染病。3 对象3. 1 疑似感染回归热螺旋体的人出境人员。3.2 采集来自流行区动物身上的虱、牌。4 标本的处理4. 1 血液标本SN/l 1718-2006 发热期病人(体温在390C以上)的血液标本采集后，室温放置1h后，用离心机3000 r/min离心15 min，吸取血清进行检测。离心后
3、的血清如在3d内检测，可放于20C80C冰箱保存;3d以上短期保存的，可在一200C冰箱保存，长期保存，应在一800C冰箱保存。4.2 尿班标本新鲜尿液标本3mL5 mL立即送检。4.3 媒介标本采集的虱、蝉10个以上用500LEDTA-Naz清洗，晾干。液氮保存或-800C以下保存。5 准备检验试剂的准备参见附录A。6 实验室检验方法入出境口岸回归热螺旋体实验室的检验方法如下:一一显微镜检测，见附录B;一一血清学检测，参见附录C;一-聚合酶链反应(PCR)检测，参见附录D。7 结果报告7. 1 显微镜检验报告7. 1. 1 直接用暗视野显微镜检查或经染色后镜检，如见到卷发样，长约为红细胞直径
4、的2倍5倍的疏螺旋体，即可报告检出回归热螺旋体;没有发现，报告未检出回归热螺旋体，同时注明检测方法。7. 1. 2 全血棕黄色层定量分析(QB，见到发荧光的螺旋体集中在交界面时，报告检出回归热螺旋SN/T 1718-2006 体;没有发现，报告未检出回归热螺旋体。7. 1. 3 动物接种后每日采血镜检，于1d2 d见到大量螺旋体，报告经日动物接种，检出回归热螺旋体;没有发现，报告经动物接种，未检出回归热螺旋体。7. 2 血清学、PCR检验报告7. 2. 1 检验结果为阴性，报告阴性，并注明检测方法。7.2.2 检验结果为阳性，报告阳性，并注明检测方法。国圃隘矗斟酌啤由比笠剖盛.，川血8 阳性结
5、果的处置对初次回归热菌复检或鉴定。阳性结果应在2 A. 1 主要试剂A. 1. 1. 1 BSKH培养精氨酸57mg/ L , 附录A(资料性附录)回归热螺旋体检验主要试荆及器材0. 106 mg/L，硫酸镜97.69mg/L，乙酸铀50mg/ A. 1. 1. 2 BSKI I SN/T 1718-2006 g/L，黄素腺瞟岭二核昔酸mg/L，葡糖醒酸铀3.88mg/L。精氨酸川g/L，拧棱酸铀8川g/-.胞嘈W扩mg/L，黄素腺瞟岭二核昔酸1.0 mg/L，凝胶14000 mg/L，硫酸镜200mg/L，主融铺88.，/y，嚼酸二氢纳140mg/L，葡糖醒酸纳4.2mg/L。A. 1. 1
6、. 3 MKM培养基A. 1. 2. 1 TBS-T( pH7. 4 三起甲基氨基甲:院(Tris)氯化铀(NaCl)氯化御(KCi)Tween-20 蒸馆水A. 1. 2. 2 EIA封闭液胎牛血清TBS-T A. 1.2. 3 TSE-Tween 氯化铀(NaCl)EDTA Tween-20 蒸馆水A. 1. 2. 4 ELISA稀释液(马血清硫酸糖昔Tween-20 PBS A. 1. 3 PCR检测试剂的配制A.1.3.1 SDS溶液氢氧化铀(NaOH)氯化铀(NaCi)2. 42 g 8.19 g 10L 0.5 mL 1 000 mL 4 g 117g 3 SN/T 1718-20
7、06 十二惋基硫酸锅。DS)蒸锢水A. 1. 3. 2 TSE缓冲液CpH8.0)三辉甲基氨基甲烧CTris)EDTA .m;糖蒸饵水A.1.3.3 TE缓冲液三在甲基氨基甲惋CTris)EDTA 蒸锢水A.2 主要器材A. 2.1 显微镜检验用器材一-普通生物显微镜;荧光显微镜;-离心机。A.2.2 血清学检验用器材一-96孔聚乙烯板;一一-37C水浴箱;一-超声波破碎仪;一一酶标检测仪、洗板机;一普通冰箱。A.2.3 PCR检验用器材一一高速台式离心机;-PCR仪;电泳仪;微波炉;荧光PCR仪;一凝胶成像分析系统或紫外线投射仪。4 50 g 1 000 mL 6.05 g 14.6 g 1
8、50 g 1 000 mL 1. 21 g 0.29 g 1 000 mL B.1 晴视野检查附录B(规范性附录)直接显微镜检测SN/T 1718-2006 将加有抗凝剂的血液、新鲜尿液1滴-2滴于玻片上，加盖盖玻片后，置于暗视野显微镜下观察，若发现两端尖削的具有5个-7个不规则疏螺旋的细长螺旋体时，再取血进行染色检查。B.2 染色检查B. 2.1 取血1滴-2滴置于玻片两端制成薄片和厚片，薄片用甲醇固定，厚片则加蒸锢水溶血，用瑞式或姬姆萨染色。B.2.2 在100X油浸接物镜下观察，可见形如曲发样染成红色或紫红色疏螺旋体。B.2.3 根据临床表现也可取脑脊液和尿液进行检查。B.3 全血棕黄色
9、层定量分析(QBC)B. 3.1 收集病人的外周血液样本，将大约55L-65L加入QBC管中，与包被在管内的盯睫橙染料混匀。B. 3. 2 塞住管口，在12000 r/min下离心5min。B.3.3 取血浆和白血球交界面的样品在荧光显微镜下用50X油浸接物镜观察有发荧光的螺旋体。B.4 动物接种后显微镜检查取病人血液2mL注射入小白鼠或幼龄大白鼠腹腔内，若标本有污染，则改作皮下注射。于次日起每日取被接种动物血液作暗视野及染色镜检，一般在注射后2d-3 d可找到螺旋体。若未检出，须继续培养检查至2周。5 SN/T 1718-2006 C. 1 酶联免疫分析试C. 1. 1 实验步骤C. 1.
10、1. 1将0.1月B.该缓冲液包被聚苯乙烯板，放于40C过夜。然后用洗液TBS-T洗涤五次。附录C(资料性附录)血清学检测方法a2C0 3 )缓冲液(pH9.的中，用苯乙烯板U型孔中(100L/孔)。设置6个C. 1. 1.7 每孔加入该嗜骨被100L(TBS-T10000稀释)，37C保温1.5h。如上洗涤后每孔再加入100L对磷酸硝基幸辑、(2吨/副榕于含1mol/L氯帧(MgC12)的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，保温O.5 h。然后用15nol/L的氢氧化铺(NaOH)(100L/孔鳝止且应。C. 1. 1. 8 405 nm下测jtA如C. 1. 2 结果判定C. 1.2.1 C.
11、 1.2.2 巳1.2.3巳1.2.4确认。C. 2. 3 对于Igr顷，如果一个区域(66，41-39和(66 , 41 -39 ，32-28，21-18kIJa.)中至少三个区域发C.3 免疫荧光分析试验(lFA)白印迹(Westernblots)实验C. 3.1 BSKH培养回归热螺旋体，离心收集菌体后用PBS洗涤两次，与羊红血细胞混匀。C. 3. 2 将细胞悬浮物制备成薄血片，室温晾干，甲醇固定后储存于一200C备用。C. 3. 3 人血清1: 16 1 : 2 048对倍稀释后进行检测。C. 3. 4 结合的抗体用100倍稀释的羊抗人IgG-异硫氨酸盐荧光素和荧光显微镜来检测。荧光浓
12、度用+十来表示，终点用比阴性对照强的最大稀释倍数记录。几何平均数滴度方法参照Perkinss method。SN/T 1718-2006 C.4 酶联免疫吸附试验CELISA)C. 4.1 培养螺旋体细胞，待浓度长到108个/mL时，12500 r/min离心收集菌体，PBS洗涤两次，菌液稀释到A600=0.05。C. 4. 2 悬浮液用超声波仪破碎细胞。悬液中蛋白浓度定量参照Bradfordassay手册。蛋白悬液放于-40C备用。C. 4. 3 用螺旋体蛋白C. 4. 4 加入200LC. 4. 5 加入100LC. 4. 6 洗涤三次后，次。h nate)显色20min , 2N Hz
13、S04终7 SN/T 1718-2006 D.1 血清标本的检测D. 1. 1 引物和探针附录D(资料性附录)PCR技术检测利用核酸序列分析软件选择回归热螺旋体鞭毛基因上一段序列作为引物，该对引物特异性高，可作使用时参考。使用BeaconDesigner2. 0软件设计分子荧光探针，荧光探针用5-tetrachloro-6-carboxy fluorescein( TET)和3-4- 4 -dimethylaminophenylazo benzoic acid (DABCYL)标记。Brec442F 5-GCTGAAGAGCTTGGAATGCAAC-3 Brec551R 5 I-GCTTCAT
14、CCTGATTTGCACCAAC-3 I Br479MBP TET-CGCGATCACCAGCATCATT ATCTGAATCACAAATCGCG-DABCYL D. 1.2 模板取1mL血清，13000 r/min离心10min，吸去800L悬浮物，残留的200L与300LSDS榕液混匀。950C温浩15min后，加入200LO. 1 mol/LTns-HCl(pH的。然后用酣、三氯甲饶、异戊醇抽提，用水溶解螺旋体DNA。为了定量PCR，用浓度为含有100 108螺旋体的目的基因的质粒进行分析。该质粒pCRIl-TOPO (包含borrelia扩增子，Br442F，Br551Rprimers
15、)由TOPOT A cloning klt 构建。D. 1.3 扩增25L体系，参照以下加样量加样:模板10X buffer含有50mmol氯化镜(MgC12)dNTP(2 mmol/L) 上游引物(10mol/L)1L 2. 5L 2.5L 1. 25L 下静号|物(10mol/L) 1. 25L 荧光探针(10mol/L)0.5L Taq酶(5U/L) 0.25L 三蒸水15.75L 反应条件:940C5 mm，然后两步法扩增940C5 s , 60oC 30 s进行45个循环。D.2 虱、啤标本检测D. 2.1 样本制备将采集的虱、蝉10个以上装入1.5 mL管中，碾碎后装人消毒的玻璃珠
16、，然后加入500L浓度为10 mg/mL的TES缓冲液。370C温浴30min，加人30L10%SDS，再温浴20min。然后15000 r/min 离心3min，将上清液转移至干净的l.5mL管中。上清液加入100L酣-三氯甲皖(1: 1)，振荡15s , 静置2min, 15 000 r/min离心15min。小心转移上层水相至一新的1.5 mL离心管中，加500L异戊醇棍匀，冰上静置10mino40C15 000 r/min离心15mm，弃上请，加入1mL 70%乙醇清洗沉淀，最后用10LTE缓冲破溶解。D.2.2 引物下列一对引物是根据回归热螺旋体鞭毛基因的一段设计，具有高度特异性，可
17、作使用时参考。阳性标本可扩增出282bp的片段。上游引物:5 -AGCTGGATCACAAGCTTCATGGACA-3 , 下游引物:5 -CCCTCT A TCTTTGCAAG TG ACA-3 D. 2. 3 扩增取PCR管编号，参照以下加样量加样:模板1L 10 X buHer 2L dNTP(25 mmol/L) 0.2L 上游引物(1mol/L)1L 下游引物(1mol/L)1L Tq酶三蒸水充分?昆匀后，在离心机上将管内液体甩入管底。0.3L 14.2L SN/T 1718-2006 进行PCR扩增，反应条件:940C 15 s，然后930C10 s , 480C 15 s , 7
18、20C 60 s，40个循环，最后720C 3 mino D.2.4 电泳检测扩增结束后在管中加入澳酣蓝，在1.5%琼脂糖凝胶(含O.5g/mLt臭化乙链)电泳，紫外灯下观察结果。9 CON-FhFHZ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出入境口岸回归热检验规程SN/T 1718-2006 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9导开本880X12301/16 印张1字数16千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-2000峰书号:155066.2-16774 7c 定价10.00SN/T 1718-2006
