1、华人共和圄出入境检验检疫行业标;SN/T 2014一2014代替SN/T20 l4-2 007 番茄黑环病毒检疫鉴定方法Deection and identification of Tomto blck ring virus 2014-04-09发布2014-11-01实施中华人民共和国发布自家质量监督栓验栓疫总局目。吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T2014-2007(番茄黑环病毒检疫鉴定方法。本标准与SN/T2014-2007相比，主要技术变化如下:一一一增加了IC-RT-PCR检测方法;增加了附录A番茄黑环病毒简介。本标准由国家认证认可监督管理委员会提
2、出并归口。SN/T 2014-2014 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张裕君、郭京泽、杨翠云、王金成、刘鹏、廖芳、刘跃庭、夏惠娟、罗加风、于翠。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一-SN/T2014-2007。SN/T 2014-2014 番茄黑环病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了番茄黑环病毒检疫鉴定的方法。本标准适用于植物种子、茵木、组培苗、无性繁殖材料中番茄黑环病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其
3、最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法3 番茄黑环病毒基本信息学名:Tomato black ring virus 缩写:TBRV分类地位:伴生豆豆病毒科(Secoviride)，线虫传多西体病毒属(Ne户ovirus)。传播途径:该病毒通过线虫(Lo吨idorusattenuatus和L.elongatus)传播、机械传播、种子(繁缕和大豆等)传播，也可通过无性繁植材料的运输远距离传播。番茄黑环病毒的其他信息参见附录A。4 原理番茄黑环病毒的生物学特性、血清学特性、分子生物学和粒体形态特性(参见附录A)是鉴定该病毒的依据。采用DAS-ELISA
4、(双抗体夹心酶联免疫吸附测定)、免疫电镜、RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)、IC-RT-PCR(免疫捕获逆转录聚合酶链反应)技术检测番茄黑环病毒。采用以上技术做出的检测结果，进行综合判定样品是否带有番茄黑环病毒。5 仪器设备、设施和用具5.1 仪器设备酶标仪、电子天平(1/10000 g)、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量榨汁机、水浴锅、高压灭菌锅、纯水仪、微波炉、磁力搅拌器、研钵研棒、低速离心机、高速冷冻离心机、生物培养箱、低温冰箱和一80oc 超低温冰箱。5.2 设施隔离检疫温室(10oc 30 OC)。5.3 用具可调微量移液器(2/1-L、10L、100L、200L、1000L、
5、5000L)及配套吸头、酶联板、离心管、研SN/T 2014-2014 钵、pH计或各范围的pH试纸条、量筒、封口膜、吸水纸、自瓷盘及摄子等。6 主要试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法检测试剂(见附录B)、鉴别寄主生物学检测试剂(见附录。、免疫电镜检测试剂(见SN/T1840)、RT-PCR及IC-RT-PCR检测试剂(见附录D)。7 番茄黑环病毒检疫鉴定方法7.1 DAS-ELISA检测具体操作步骤见附录B。7.2 鉴别寄主生物学检测具体操作步骤见附录c7.3 RT-PCR及IC-RT-PCR检测具体操作步骤见附录Do7.4 免疫电镜检测按照SN/T1840的8 结果判断9 记录结果与样品保
6、存9.1 记录结果记录实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果应有吸光值的数据报告，生物学检测应有鉴别寄主的典型症状照片，免疫电镜检测应有病毒粒子的照片，RT-PCR检测和ICRT-PCR检测应有电泳结果照片。9.2 样品保存确定携带番茄黑环病毒的样品应在适合的条件下保存，如植物种子4oC冷藏，病叶、病株在800C 冰箱中保存或冻干后4oC保存，保存期至少l年。做好登记和标记工作。2 A.1 寄主植物附录A(资料性附录)番茄黑环病毒简介SN/T 2014-2014 寄主范围:番茄黑环病毒能够广泛侵染单子叶、双子叶草本和木本植物，主要寄主有番茄、黄瓜
7、、辣椒、茄子、韭菜、芹菜、甘蓝、洋葱、V主监委主七却要寸票、马给弄甘莫非菁、水仙、唐富蒲、草莓、繁缕、大豆、胡椒、黑莓、覆盆子、悬钩子、棋赛辆三摆醋时兹去样铃等。鉴别寄主:昆诺翠或克色葱，薛戴辛豆豆;是荼毒海番滋油田普通烟，克利夫兰烟。A.2 分布地区欧洲:克罗地亚、捷克、丹麦、芬兰波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、亚洲:印度、日本、中国、土耳非洲:肯尼亚、摩洛哥。美洲:巴西、加拿大、美国。大洋洲:加罗林群岛。A.3 粒体形态番茄黑环病毒粒体为等轴成分(M颗粒和B颗粒)，沉降A.4 基因组特征番茄黑环病毒含有两个基RNA-l大小为7.358kb;RNA-2 编码病毒外套蛋白质的基因。TBRV颗粒
8、沉积物有两个核蛋白RNA-l和M颗粒中的RNA-2o4.662 kb(德国血清型)0 RNA-2包含3 SNjT 2014-2014 附录B(规范性附录)DAS-ELISAC双抗体夹心酶联免疫吸附测定)检测B. 1 式剂. 1. 1 10 x PBST缓冲液(pH7.4) 将氧化饷(NaCI)80 g、磷酸工氢怦(KH2PO，)2g、磷酸氧二饷(Na2HPO，)1 1. 5 g、氧化钊1(KCl) 2 g、叠氮的(Na凡)0.2g、吐温20(Twee丑-20日mLt容于900mL的蒸饵水中，用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4，并定容至1000 mLc B.1.2 样品抽提缓冲液CpH7.4)
9、将亚硫酸1;1j(Na2 SOj) 1. 3 g、聚乙熔基毗咯皖附C MW 24 000 40 000. PVP) 20 g、叠氮饷CNaN，)0.2 g、|吐温20C Tween-20 ) 20 mL 容于;900 mL的1X PI3ST中，HJHCl调节pH至7.4，定容至1000 mL , B. 1. 3 包被抗体缓冲液CpH9.6) 将碳酸讷C:Ja2C()1)1. 59 g、碳酸氢1;rj(NaHCO j ) 2. 93 g、桑氮饷CNaN;)0.2 g、辟解于900mL蒸惚水中，用浓盐酸CHC)调节pH至9.6，并定容至1000 mL。B.1.4 洗涤缓冲液(pH7.4) 1 X
10、PI3ST缓冲I液，jFJ浓盐酸CHC)调节pH至7.4。B.1.5 酶标抗体缓冲液CpH7.4) 将1XPBST缓冲液800mL、小牛血清蛋白(BSA)2g、PVPCMW24 00040 000)20 g、叠氮铀(NaN j )0.2 g用元菌蒸馆水定容至1000 m L, B. 1. 6 底物(pNPP)缓冲液CpH9.8) 将二乙醇胶97mL、叠氮铀(NaNj)0.2 g l容解于600mL的无菌水中，m浓盐酸(HC)调节pH至9.8，然后用蒸馆水定容至1000 mL。B. 1.7 底物(pNPP)溶液每对硝基苯磷酸讷(pNPP)海解于pNPP缓冲液中，浓度1mg/mL，根据实际需要现配
11、现用，并注意避光以防止变色。B.1.8 反应终止液氢氧化铀(NaOH)l20g 溶于1000 mL的元菌蒸偏水中，浓度3mol/L。B.1.9 种子表面消毒液.夺30%的次氯酸铀(NaC10)100 mL 溶解于900mL的蒸饵水I制成浓度为3%的消毒液。4 SN/T 2014-2014 B.1.10 生物制剂番茄黑环病毒特异性包被抗体、碱性磷酸醋酶标记的番茄黑环病毒抗体，或者番茄黑环病毒检测试剂盒。注:未作特殊说明，所使用试剂均为分析纯。上述缓冲浪Ic保存，使用前将溶液温度恢复于室温使用。B.2 检摆1方法B. 2.1 样品制备B.2. 1. 1 种子类f寺检种子!有清水冲洗，置于30%的次
12、氯酸纳(NaC10)溶液中浸泡10min做表面消毒，用无菌水洗涤3次。将消毒后的种子置于铺有吸水纸的瓷盘中，在生物培养箱中催芽，长出幼叶作为检测样品。用微量榨汁机或1iJft本研磨样品，样品质量和抽提缓冲液体积比为1: 10。制备的汁液按照标记分别移入离心管J:I:t瞬时离心，吸取上清液作为待检测样品液。B. 2.1.2 鳞球(块)茎类鳞f才i茎或块茎催芽，长出叶片，随机抽取生长叶片或直接用解剖刀切取鳞球茎L的鳞片组织作为样品，用微量榨汁机或研钵研磨样品.样品质量和抽提缓冲液体积比为1: 10。制备的汁液按批号分别盛装于离心管中，瞬时离心吸取上清液作为待检测样品液。B.2. 1. 3 种苗类对
13、同一批号的植株叶片进行随机取样，用微量榨计机或研钵研磨样品，植物组织质量和抽提缓冲液体积比为1: 10，制备的汁液分别盛装于离心管中低速离心后，吸取上清液待用。B.2.2 DAS-ELISA操作步骤B.2.2.1 根据检测需要确定晦联板点样孔，包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔。f寺测样品孔重复2次。B. 2.2.2 用包被抗体缓冲液按照要求稀释TBRV的包被抗体，每孔加入100L的TBRV的包被抗体恪液，封口腰包好，37C孵育2h4 h(或4c冰箱过夜)。B. 2.2.3 空干酶联板中溶液，用200fJ-L的1XPBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min，然
14、后在干净毛巾或l1!E，纸扣干。B.2.2.4 将100fJ- L 待检测样品液加入到待检测孔中，对照孔中也各加入100L相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37C孵育2h3 h(或4oC冰箱过夜)。B. 2.2.5 空干孔中溶液，用1XPBST洗涤，步骤与B.2.2.3的要求相同。B. 2.2.6 用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体，每孔加入100fJ-L酶标抗体溶液，封口膜包好，并于370C孵育2h4h。B. 2.2.7 洗涤，步骤与B.2.2.3的要求相同。B.2.2.8 将pNPP榕于底物缓冲液中，使最终浓度为1mg/mL。每孔加入100fJ-L配好的底物溶液，室温孵
15、育0.5h2 h。必要时每孔加入50L的3mol/L氢氧化饷榕液终止反应。B.2.2.9 分别在0.5h , 1 h时观察判断酶联板颜色反应，用酶标仪读取OD，oJ数值。B. 2.3 其他若用商品化番茄黑环病毒酶联检测试剂盒，则按照试剂盒说明进行操作。俨3 SN/T 2014-2014 B.3 结果判定B.3.1 质量控制要求缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照OD/阴性对照OD405大于310，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按照式(B.1)进行计算:式中:P一一平行允许率;OD j 重复样品1的OD4056
16、 样品OD/阴性对照一一一样品OD405/阴性对照验证;样品OD405/阴性对照P OD, OD? V. _ ， x 100% (ODj十ODz)X 1/2 ( B. 1 ) 果有效。应重做一次或者用其他方法进行SN/T 2014-2014 附录C(规范性附录)鉴另IJ寄主生物学检测C.1 鉴别寄主昆诺黎(町ChenOodi川mqZO)或克色黎(优C.m阳r川tlCol归or忖)，茧黄白瓜(C丁丁u盯cuJ川n川1门t(Pllase削Eol(Nic川O)tzana川t巾i红L)，普通烟(N阳b归m川)包括白肪烟CN.b归Cl川c牛L川.川矶Thitebu川巳y)和三生班烟!(Nb归 C叫umc
17、v.Samsun NN)，克和j夫兰烟(N.clevelandii)为鉴别寄主植物。;C. 2 式齐。1%磷酸盐缓冲液(pH7.4)、金刚砂。C.3 检测方法C.3.1 研磨病样加上1: 1的磷酸盐缓冲液C.3.2 接种将金刚砂加入病样汁液中C.3.3 冲洗用自来水冲洗接种过的C.3.4 标记做好标签，记上接种病毒种类、C.3.5 观察/ J / / J J 在隔离温室中，每天观察并记录鉴别寄主的反应。C. 4 结果判定/ J 户f / J 依据寄主的反应症状进行判定，符合以下症状的则结果判定为阳性:昆诺葱或克色黎:接种4d6 d后，接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳;黄瓜:接种5d7
18、 d后，接种子叶出现局部退绿斑或小坏死环斑或黄斑，然后出现系统环线脉，畸形;一一Princ巴菜豆:接种5d7 d后接种叶出现局部褪绿，坏死或畸形;一一一矮牵牛:接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，然后出现系统褪绿环斑或线纹或明脉;7 SN/T 2014-2014 8 一一番杏:接种3d7 d后接种叶出现细轮纹、环斑;黄花烟:接种叶产生局部褪绿或坏死斑或环;一一一普通烟的自肋烟或三生烟:接种叶产生局部坏死环和斑点，系统斑点、环或线条斑;一一克利夫兰烟:接种叶产生局部环斑。附录D(规范性附录)RT-PCR检测及IC-RT-PCR检测D.1 式剂D. 1. 1 Trizol RNA提取试剂或RNA抽提试剂
19、盒D. 1. 2 50xTAE Tris 冰乙酸0.5mo1/ L EDTA 用时加蒸馆水稀释至1XTAE。D. 1. 3 PBST缓冲液(pH7.4) 242 g 52.1 mL 100 mL SN/T 2014-2014 将氧化饷CNaCD80 g、磷酸二氢饵CKHzPOj)2g、磷酸氢二铀CNa2日POj ) 11. 5 g、氧化悍CKCD2 g、叠氮饷CNaN.1)0.2 g、吐温20CTween-20)5mL榕于900mL的蒸馆水中，用浓盐酸CHCD调节pH至7.4，并定容至1000 mLo 4 oC冰箱保存。使用前用蒸恼水按1: 10稀释。D.1.4 番茄黑环病毒特异性包被抗体溶液
20、包被抗体缓冲液:将碳酸铀CNa2C03)1.59g、碳酸氢铀CNa丑C03)2.93g、叠氮铀CNaN3)0.2 g i容解于900mL蒸锢水中，用浓盐酸CHC)调节pH至9.6，并定容至1000 mL。用包被抗体缓冲液，按试剂说明书要求的比例稀释TBRV包被抗体。D. 1. 5 合成的番茄黑环病毒引物根据番茄黑环病毒RNA-2保守序列设计特异引物，序列为:TBRV F-1 , 5 -CGCT AGAAGTGAGCCT A TG一3TBRV R-1 :5 -TCAGCTAGGAGTTTCGCAG-3 D.2 RT-PCR检测D.2.1 RNA提取D.2. 1. 1 取0.1g样品，液氮研细，加
21、入1mL Trizol，混匀，倒入1.5mL离心管中。D.2.1.2 加入0.2mL三氯甲皖，振荡15s ,4 oC 11 000 r/min离心10min，吸取上层无色水相到新离心管中。D.2.1.3 加入等体积异丙醇，混匀，一20oC静置10mi口，4oC 12 000 r/min离心15mi口，保留沉淀。D.2. 1. 4 加入1mL 75%冷乙醇，悬浮沉淀，4oC 8 000 r/min离心10min，干燥沉淀。D.2.1.5 加入30LDEPC水，榕解沉淀(必要时55oC 60 oC水浴10min，加速府解)，存于一80oC 备用。9 SN/T 2014-2014 D.2.2 反转录
22、反转录体系20L，8LDEPC水、1L反向引物(20mol/L)、2L提取的RNA，70oC反应10 min，冰上放置3min，加入5L的AMV酶5X缓冲液、2LdNTP( 10 mmol/L)、1L的AMV反转录酶(200U/L)、ILRNA酶抑制剂(40U/L) ,42 oC反应1ho D.2.3 PCR t广t曾反应体系:25L，其中3L反转录产物、2.5L10 X PCR缓冲液、2LMgCl (25 mmol/L)、0.5L dNTP (10 mmol/L)、0.2L下游引物(20mol/L)、0.2L上游引物(20mol/L)、0.3LTaq DNA聚合酶(5U/L)和DEPC水反应
23、条件:940C4 min;94 oC D.2.4 其他D.2.5 琼脂糖;疑胶电泳与结果观察制备1%的琼脂糖凝胶，按比例量标记，进行电泳分析。电泳结束后并拍摄记录。D.2.6 结果判定质量控制要求:阴性对照不出在满足质量控制要求条件下，D.3 IC-RT-PCR检测D.3.1 免疫捕获番茄黑环病毒番茄黑环病毒特异包被抗体溶D.3.2 反转录;720C 10 min延伸。，用DNAMarker作为分子扩增出预期的特异性条带，定检测样品为阳性。PBST洗涤3次。样品液包被反转录体系20L，10LDEPC水、1L反向引物(20mol/L), 70 oC反应10min，冰上放置3 min，加入5L的A
24、MV酶5X缓冲液、2LdNTP (10 mmol/L)、1L的AMV反转录酶(200 U/L)、1LRNA酶抑制剂(40U/L) ,42 oC反应1h。D.3.3 PCR扩增同D.2.3。D.3.4 其他同D.2.4o10 D.3.5 琼脂糖;疑胶电泳与结果观察同D.2.5。D.3.6 结果判定同D.2.6。SN/T 2014一2014立ON|叮FONH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准番茄黑环病毒检疫鉴定方法SN/T 2014-2014 ?夺中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区兰里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址WWW.spc.日创.cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷必开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数1-1300 今毛书J号:155066 227860 定价18.00元SN/丁20142014
