1、GB 18466-2001 前本标准中第4章、5.1，5.4，5.5条为强制执行条文，其他为非强制执行条文。本标准是对GB48-198395 传染病医疗机构二月o 不得检出95 结核病医疗机构10 不得检出95 其他医疗机构二三10-, 一.95 5 卫生要求5. 1 医疗机构污水必须进行处理和消毒。医疗机构污水处理构筑物中的污泥必须经过无害化处理。未经消毒或无害化处理的污水、污泥，不准任意排放或用做农肥。5. 2 新建、扩建、改建医疗机构应同时进行污水处理设施建设，其污水及污泥排放应符合表1和表2的规定。5.3 医疗机构污水和污泥经处理和消毒后排放时，所含有害物质的含量还应根据接纳水体和粪便
2、无害化卫生标准的功能要求，符合G5749、G3838、G5084、GB11607、GB7959、GB12941、GB/T14848 中的要求。5.4 严禁各级各类医疗机构将污水、污泥排人生活饮用水水源卫生防护地带内。5. 5 严禁各级各类医疗机构采用渗井、渗坑排放污水、污泥。5. 6 医疗机构污水处理构筑物的位置，宜设在医疗机构建筑物当地夏季最小频率风向的上风侧.与周围建筑物之间宣设绿化防护地带。5. 7 医疗机构污水处理构筑物的设计，应满足下列要求z1 )确保污水、污泥符合本排放标准;2)采取防腐蚀、防渗漏措施;3)备有发生故障时的临时消毒设施;4)使用液氯消毒，必须备有氯泄漏等事故发生时的
3、应急处理设施，严禁直接以钢瓶向污水中投加氯气;5)安全耐用，操作方便.有利于操作人员的劳动保护。5. 8 医疗机构行政区和职工生活区的污水，应与病区的污水分流。6 检测与监测6. 1 医疗机构污水、污泥处理的日常检测由各医疗机构负责。检测项目和频次应符合以下要求.6. ,. 1 医疗机构污水中总余氯z经过连续处理装置的污水，每日至少检测2次;经过间隙式处理装置的403 GB 18466-2001 污水，每次排放前均应检测。6. 1. 2 医疗机构污水中粪大肠菌群2每月检测不得少于1次。6. 1. 3 医疗机构污水中致病菌z每年检测不得少于2次。主要检测沙门氏菌和志贺氏菌，结核病医疗机构检测结核
4、杆菌。6. 1.4 医疗机构污泥的卫生指标z每批污泥排放前，均应按表2要求的项目检验。6.2 各级卫生防疫机构，应对辖区内医疗机构污水、污泥处理情况进行经常性卫生监测。并做好辖区内新建、改建、扩建医疗机构污水处理设施的预防性卫生监督工作。6. 2. 1 监测频次传染病、结核病医疗机构污水每年监测至少6次$其他医疗机构污水每年监测至少4次。医疗机构污泥每次排放前监测。6.2.2 污水监测项目z总余氯、粪大肠菌群、肠道致病菌$结核病医疗机构增测结核杆菌。6.2.3 污泥监测项目z翩虫卵死亡率、粪大肠菌值3传染病医疗机构培测肠道致病菌;结核病医疗机构增测结核杆菌。7 检验方法本标准检验方法按附录A、
5、B、C、D、E、F、G执行。404 A1 仪器和设备A 1. 1 天平。A 1.2 比色管。A 1.3 量筒。A2 试剂GB 18466-2001 附录A(标准的附录)医疗机构污水中总余氯的检测方法邻联甲苯胶溶液z称取1g邻联甲苯胶，榕于5mL 20%(容积/容积)盐酸中，将其调成糊状，加入150200 mL蒸恼水使其完全溶解，置于量筒中补加蒸馆水至505mL.最后加人20%盐酸495mL，储于棕色瓶中。A3 测定步骤A3.1 被测样品温度宜为1520C.如低于此温度，应先将样品浸人温水中使其温度刑至1520 ( 后，再测定数值。A3.2 拍盛有5mL样品的比色管内，滴加邻联甲苯胶溶液23滴，
6、混匀。A 3. 3 将样品置于黑暗处，静置15min后.与永久性余氯标准比色榕液比色测定，其结果为样品总余氯含量(比色时，眼睛从管口向下观察或由前面观察)。A3.4 如余氯浓度很高时，会产生桔黄色，当样品碱度过高以及余氯浓度低时，可能产生淡蓝绿色或淡蓝色。此时.可再加入1mL 1 2盐酸或1mL邻联甲苯胶溶液，即可产生正常的淡黄色.再进行测定。A4 检验结果报告检验结果以每升污水中含总余氯的毫克数(mg/U报告。附录B(标准的附录)医疗机构污水中羹大肠菌群的检验方法B1 仪器和设备B1.1 高压蒸汽灭菌器。B1.2 T燥灭菌箱。B1. 3 培养箱。B1.4 电炉。B1.5 夭平。B1.6 灭i
7、辑平皿。B1.7 灭菌刻度吸管。405 B2 培养基和试jlJB2.1 乳糖胆盐培养液B2. 1. 1 成分蛋白陈猪胆盐(或牛、羊胆盐)乳糖0.4%澳甲liI)紫水溶液蒸馆水B2. 1. 2 制法GB 18466-2001 20日5 g 5日2.5 mL 1 000 mL 将蛋白陈、胆盐及乳糖洛解于1000mL蒸馈水中.调整pH为7.27. 40加入指示剂，充分混匀.分装于有倒管的试管中。置于高压蒸汽灭菌器中，于115C灭菌20min。贮存于冷暗处备用。B2.2 伊红美兰培养基B2.2.1 成分蛋白豚乳糖磷酸氢二梆琼脂蒸锢水2%伊红水溶液10 g 10 g 2g 2030日1000 mL 20
8、 mL 0.5%美兰水溶液13 mL B2. 2. 2 储备培养基的制法B2.2.2.1 先将琼脂加到900mL蒸馆水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二饵及蛋臼陈，混匀使溶解，再以蒸饱水补足至1000 mL，调整pH为7.27. 40 B2.2.2.2 趁热用脱脂棉或绒布过t茧，再加人乳糖，混匀后，定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭南器中，以115C灭菌20min。贮存于冷暗处备用。B2. 2. 3 平皿培养基的制法B2.2.3.1 将已制备的培养基加热融化。82.2. 3. 2 根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5%美兰水榕液加人已融化的
9、储备培养基内，并充分混匀防止产生气泡)。立即将此种培养基适量倾人已灭菌的空平皿内，待其冷凝后，备用。B2.3 乳糖蛋白陈培养液B2. 3. 1 成分蛋白陈10 g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化锅5日1.6%澳甲盼紫乙醇溶液1 mL 蒸馆水1 000 mL B2. 3. 2 制法将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化例加热溶解于1000 mL蒸馆水中，调整pH为7.27. 40加人1.6%澳甲酣紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于有倒管的试管中。置于高压蒸汽灭菌器中，以115(灭菌20min。贮存于冷暗处备用。406 B2.4 革兰氏染色液B2. 4. 1 结晶紫染色液结晶紫GB 18466-2001 1 g
10、 95%乙醇20mL 1%草酸镀水溶液80 mL 将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸镀水溶液混合。B2. 4. 2 革iL氏硕液串起1 日腆化何2g 蒸馆水300 mL 将腆与腆化饵先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解，再加入蒸饱水至300mL , B2. 4. 3 脱色液，95%乙醇。B2. 4. 4 沙黄复染液沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL 将沙黄溶于乙醇中，然后用蒸饱水稀择。B2.5 染色法B2. 5. 1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗。B2.5.2 滴加革兰氏碗液，作用1min，水洗。B2. 5. 3 滴加95%乙醇脱色.约
11、30s，水洗。B2. 5. 4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。B2.6 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注亦可用1I 10稀释的石炭段草红染色模作重染液.复染时间为0So B3 检验程序B3- 1 采样方法用采水器或其他灭菌容器采取污水样1000 mL，放人灭菌瓶内，如果是经过加氯消毒处理的污水，需加1.5%硫代硫酸纳溶液5mL中和余氯。B3.2 多管发酵法B3- 2. 1 初发酵实验:将原液作1 10、1, 100、1, 1 000稀释。依次吸取1 1 000、1 100、1 10及原液各1mI.，分别连人装有10mL乳糖胆盐培养液内装小发酵管的试管中，将已接种
12、的囚支发酵管置于44 C恒温培养箱内培养24h。洼，接种量为10ml.时，可用与接种量相等的双料乳糖JI!盐培养液。B3- 2. 2 平板分离:取经培养24h后产酸产气，以及只产酸不产气的发酵管中培养液，分别划线接种伊红美蓝培养基上，量37C恒温培养箱内培养1824h，挑选符合下列特征的菌落，进行涂片，革兰氏染色，镜检。伊红美蓝培养基上的菌落色泽:深紫黑色，具有金属光泽的菌落;紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落;淡紫红色，中心色较深的菌落。B3. 2. 3 复发酵实验z上述涂片镜检的菌落.如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，再挑取该菌落接种于乳糖发酵管中(内有倒管)，置于44C恒温培养箱中培养24h，有产
13、酸产气者即证实有粪大肠菌群存在，按阳性管数查表。401 GB 18466-2001 视其水质污染程度.决定稀释度和接种量。例如，污染较轻可接种总量11.11 mL，如污染严重可接种总量。.1111 mL。接种样品量.mLo. 1 0.01 十十才+ 十十十+ + + + + + 十+ 十+ 十十+ + 十十+ B4 检验结果报告表B1粪大肠菌群检索表(接种总量1.111mL) 0.001 + 十+ 十+ 十十+ 粪大肠菌群.MPN/L238000 接种水样总量同表B1，检验结果可直接查表，得出粪大肠菌群数(MPN值);如接种水样总量比表I大10倍01.11 mL)，检验结果为查表所得MPN值除
14、以10。附亵C(标准的附录)医疗机构污泥中羹大肠菌值的检验方法C1 仪器和设备C1.1 高压蒸汽灭菌器。C1.2 于燥灭菌箱。C1.3 培养箱:37C。C1.4 恒温水浴箱。C1.5 电炉。C1.6 天平。C1.7 灭菌平皿，, c1. 8 灭菌刻度吸管。408 C2 培养基和试剂C2.1 乳糖胆盐培养基:同附录B2.10 C2.2 伊虹美兰培养基同附录B2.2。C2.3 乳糖蛋白陈培养液2同附录B2.30 C2.4 革兰氏染色液:同附录B2.4。C3 检验程序G8 18466-2001 C3. 1 初发酵试验:按图C1所示将污泥稀释.分别将污泥样品接种于盛有10mL乳糖胆盐培养液的试管中(内
15、有小倒管)。再将已接种的四支试管置于44C恒温培养箱中，培养24ho 污泥1g加I 王菌水100mL 理2mL(相当污泥Ig)加IIJ内有小倒营的盎醉曹中取O.2mL(相当污掘。.Ig)加到内有小倒曹的童酶曹中2 mL / 取1mL(相当污泥0.01g)加到内有4、倒曹的直醇曹中图C1污泥的稀释和接种示意图98mL 无菌*4 取O.1时.(相当情呢O.OOlg)拥到内有小倒曹的童醇曹中C3. 2 平板分离经24h培养后，将产酸产气及只产酸不产气的发肆管培养液分别划线接种于伊红美兰培养基上。置于37C恒温培养箱中培养1824ho挑选符合下列特征的菌落，进行涂片，革兰氏染色，镜检。伊红美兰培养基上
16、的商落色泽z深紫黑色，具有金属光泽的菌落z紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落;淡紫红色，中心色较深的菌落。C3. 3 复发酵试验g上述涂片镜梭的菌落如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于内有倒管的乳糖发酵管中，置于44C恒温箱培养24h。有产酸产气者UP证实有粪大肠菌群存在。接种总量.g1 O. 1 0.01 + + + 十十+ 十十+ 表C2粪大肠菌值检索表(接种总量.111 g) 0.001 十+ + + 粪大肠菌值1. 11 1.11 1.11 1. 05 0.56 0.53 0.46 0.43 0.36 409 GB 18466 2001 表czc完)接种总肘，日o.
17、1 0.01 0.001 斗+ + + 一+ 十十 4 十十十C4 检验结果报告根据经证实的粪大肠菌群阳性管数，按表C2报告粪大肠菌值。附录D(标准的附录)医疗机构污水及污泥申沙门民菌的检验01 仪器和设备01.1 高压蒸汽灭菌器。01.2 干燥灭商箱。01- 3 培养箱。0 1- 4 恒温水浴箱。01- 5 电炉。01.6 天平。01.7 灭菌平皿。01.8 灭菌刻度吸管。02 培养基和试剂02.1 亚晒酸盐(SF)增菌液02. 1. 1 成分膜蛋白陈(或多价陈)磷酸氢二销(Na，HPO.，)磷酸二氢销(NaH，PO，) 乳糖亚硝酸氢销蒸馆水02. 1. 2 制法10 g 16 g 2. 5
18、日4g 4g 1 000 mL 粪大肠菌值。11。100.06 0.01 O. 01 。川)10.004 |徐亚刷酸氢纳外，将以t:各成分放于蒸馆水中，加热溶化。再加人亚晒酸氢俐，待完全溶解后.调镀pH为7.O7. 1。分装，于流通蒸汽灭菌器中灭菌15min备用。410 02.2 SS 培养基02. 2. 1 基础IZ养墓02.2.1.1 成分牛肉膏示肠、三号胆就琼脂蒸馆水D2. 2. 1. 2 制法GB 18466-2001 5 g ) g 3.5 g 17 g 1 000 mL 将牛肉膏、示陈和胞盐溶解于400mL蒸恼水中，将琼脂加入600mL蒸f菌水中，煮沸使其溶解，罚将二者混合.121
19、C高压灭菌5 min，保存备用。02.2. 2 完全培养基02.2.2.1 成分基础培养基乳糖拧橡酸纳硫代硫酸锵10%拧橡酸铁溶液1%伊性红挥手液。.1%煌绿济液02.2.2.2帘l法1 000 mL 10 g 8.5 g 8.5 g 10 mL 2.5 mL 0.33 mL 加热溶化基础培养基，按比例加入上述染色液以外的各成分，充分混合均匀，调整pH为7.O.加入中性红和煌绿浴液，倾注平板。注制好的培葬基宜当日使用，或保存于冰箱内于18h内使用。煌绿溶液配好后应在10天以内使用。02.3 亚硫酸锵琼脂BSl02. 3. 1 成分蛋白陈牛肉膏葡萄糖硫酸亚铁磷酸氯二锅煌绿拧橡酸铭、钱亚硫酸纳琼脂
20、蒸馆水D2. 3. 2 制法10 g 5g 5g 0.3 g 4 g O. 025 g 2日6g 18-20 g 1 000 mL 将前面5种成分溶解于300mL蒸馆水中;将拧橡酸能镀和亚硫酸销另用50mL蒸馆水溶解;将琼脂f600 mL蒸情水中煮沸潜解，冷至80C。将前三种浴液混合.补充蒸倒水至1000 mL.调整pH为7. 5，加0.5%煌绿水溶液5mL.摇匀。冷至50-55(.倾注平皿。It. 此精弄墨习、IU高压灭菌。应在临用前-x制备，贮存于重温暗处.超过1Hh不宜使用。411 G 18466 2001 02.4 二糖铁坡、脂(T5Jl02.4.1 成分蛋白助;20 g 牛肉膏 g
21、乳糖10 g 煎糖10 g 葡萄糖1 g 氧化纳5g 硫酸亚铁镀0.2 g 硫代硫酸俐0.2 g 琼脂12 g 酣红O. 025 g 蒸馆水1 000 mL 02.4. 2 制法将除琼脂和盼红以外的各成分溶解于蒸饱水中，调pH为7.40加入琼脂.加热煮沸，再加人0.2%勘红水溶液12.5mL.摇匀。分装试管，装量宜多些，以使得到较高的底层。121(高压灭菌15min 0放置高层斜面备用。02.4. 3 沙门氏菌属诊断血清03 撞测程序03.1 样品处理和增菌污水z取250mL污水，用无菌纱布或脱脂锦进行初滤，然后再用滤膜进行抽滤。将初滤后的纱布或脱脂棉和滤膜，放人到盛有100mL左右的单倍SF
22、增菌液的三角烧瓶中进行增离培养。置于37(恒温培养箱，培养24h. 污泥:用灭菌匙称取污泥30g.放人灭菌容器内.加入300mL灭菌水，充分混匀制成1: 10混悬液。吸取t述1: 10 I昆悬液100mL.加于100mL双料亚晒酸盐(SF)增菌液内，置于37(恒温培养箱，培养24九)3. 2 、l板分离取t述t曾菌培养液，分别接种55平板和BS平板，置于37(恒温培养箱培养2448h 0观察各于板l生长的商落特征。3.3挑选菌落挑取在55平板上呈无色透明或中间有黑心，直径1-2mm的菌落g挑取在B5平板上皇黑色11金属先碎的商落或灰绿色的菌落。每个平板最少挑取5个以上可疑肠道病原菌菌落，转种三
23、糖铁培养基中，置于37C恒温培养箱中，搞养18-24h。3.4 生化试验放血清学检验在三糖铁培养基中，如不发酵乳糖，发酵葡萄糖产酸产气或只产酸不产气，般产生硫化氢，有动力者.先与沙门氏A-F群0多价血清作玻璃片凝集，凡与多价。血清凝集者，再与0因子血清凝集，以确定其所属群男IJ.然后用H因子血清.确定血清型。双向商株应证实两相的H抗原.有Vi抗尿的两型(伤寒和l勾塑1画IJ伤寒沙门氏菌)应用Vi因子血清检查。4IZ GB 18466-2001 生化试验z应进行葡萄糖、甘露西事、麦芽糖、乳糖、R军糖、自童基质、硫化氢、动力、尿素试验。沙门民菌属中除伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌不产气外，通过发酵葡萄糖
24、、产气、均发酵甘露醇和麦芽糖(但猪沙门氏菌、雏沙门民菌不发酵麦芽糖)，不分解乳糖、II糖，尿素酶和曹童基质为阴性，通常产生硫化氢。除鸡、雏沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的0型菌株无动力外，通常均有动力。如遇多价O血清不凝集而一般生化反应符合上述情况时，可加做侧金盏花醇、水杨素和佩化御试验，沙门氏菌均为阴性。D4 检验结果报告根据以上鉴别培养、生化试验和血清学检验结果报告结果。附录E(标准的附录)医疗机构污水及污泥申志贺民菌的检验方法E1 仪辑和设备E1.1 高压蒸汽灭菌器。E1.2 干燥灭菌箱。E1.3 培养籍。E 1.4 恒温水浴箱。E1.5 电炉。E1- 6 天平.E1.7 灭菌平皿。E1- 8
25、灭菌费l度吸管。E2 楠，事基和试剂E2.1 革兰氏阴性(GN)增菌液E2. 1. 1 成分腕蛋白陈或多价陈葡萄糖甘露醇掏橡酸销去氧胆酸纳磷酸氢二锦磷酸二氢梆氯化销蒸馆水E2. 1.2 制法20 g 1 g 2g 5g 0.5 g 16 g 2.5 g 5g 1000 mL 将以上各成分加入蒸馆水中溶化，调整pH至7.0，煮沸过滤，高压115CC灭菌20min。贮存于冷暗处备用。双料GN增菌液配制z除蒸馆水改为500mL外，其它成分不变。E2.2 55培养基2同附录D2.2。E2.3伊红美兰琼脂(EMB)，同附录B2.2。413 E2.4 三糖铁琼脂T5J)，同附录D2.4。E2.5 志贺氏菌
26、诊断血清E3 检验程序E3. 1 样品处理和增菌GB 18466-2001 污水取污水250mL.用无菌纱布或脱脂棉进行初滤，然后再用滤膜进行抽滤。将初滤后的纱布或脱脂棉和滤膜，放入到盛有100mL左右的单倍GN增菌液的三角烧瓶中进行增菌培养。置于37C恒温培养箱，培养6-8h , 污泥:用灭菌匙称取污泥30g.放入灭菌容器内，加人300mL灭菌水，充分混匀制成1 10 1.昆悬液。吸取上述1 10混悬液100mL.加到100mL双料革兰氏阴性(GN)增菌液内.置于37C恒温培养箱，培养6-8h。E3. 2 分离取上述增菌培养液，分别接种55平板和E.M. B.平板，置于37C恒温培养箱中，培
27、养24ho 挑取在55和E.M. B.平板上呈无色透明，直径1-)，5 mL的菌落。每个平板最少挑取5个以上可疑肠道病原菌菌落，转种三糖铁培养基中，置于37C恒温培养箱中，培养18-24h , 挑取在三糖铁培养基中，葡萄糖产酸不产气，无动力，不产生硫化氢，上层斜面乳糖不分解的菌株.可做血清学和生化试验。E3.3 血清学检查=志贺氏菌属分为四个群，先与多价血清作玻璃片凝集试验，如为阳性，再分别与A、B、C、D群血清凝集，并进一步与分型血清做玻璃片凝集，最后确定其血清型。E3.4 生化试验2应进行葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、II糖、能基质、硫化氢、动力、尿素试验。志贺氏菌属能分解葡萄糖，但不产气
28、(福氏志贺氏菌6型有时产生少量气体).一般不能分解乳糖和II糖，宋内氏志贺氏菌对手L糖和原糖迟缓发酵产酸。志贺氏菌属均不产生硫化氧，不分解尿素，无动力。对甘露醇、麦芽糖的发酵及青童基质的产生，则因菌株不同而异。如遇多价血清玻璃片凝集试验为阴性，而生化反应符合上述情况时，可加做肌醇、水杨素、v-p、橡酸盐、氟化御等试验。志贺氏菌属均为阴性反应。附录F(标准的附录)医疗机构污泥申蝠虫卵的枪验方法F1 仪器和设备F1.1 离心机。F1.2 金属筛.60目。F1.3 显微镜。F1- 4 恒温培养箱。F1- 5 高压蒸汽灭菌器。F1- 6 冰箱。F1.7 振荡器。414 F2 培养基和试剂F2. 1 3
29、%5%福尔马林或3%盐酸溶液。F2.2 饱和氯化纳溶液。F2. 3 30%次氯酸锹溶液。F3 检验程序F3. 1 污泥样品的采集GB 18466-2001 先把泥堆tJ分为四等份.而后在每份的中间，用铁锹或小铲各采污泥约500g。同时.在泥堆的中间也采500g并放在塑料桶或陶瓷桶中。搅拌均匀，并除去固体杂物，再从中取出500g置于塑料袋或其他容器中，带回实验室。F3. 2 污泥样品的处理将现场带回的样品.倒于烧杯中.如遇样品变干且有结块时，可将其倒入搪涟盘中，再行搅拌，同时用大慑子，一面搅拌，一面将硬块夹碎，去掉肉眼能看出的夹杂物，如腐烂的布条、草梗、小石块等。然后，将样品装入广口瓶中，贴上标
30、签，标明样品号码、医疗机构名称、采样日期等情况。F3. 3 污泥样品的检验上述样品经处理后，应立即进行检验，如不能立即检验时，可加入510mL 3%5%福尔马林或3%盐酸溶液，用平皿盖住广口瓶瓶口。然后放于冰箱内，以防微生物的繁殖和姐虫卵的发育。F3. 3- 1 水洗从已经处理过的500g污泥样品中，称取100g置于500mL锥形瓶中，加水约500mL。用玻璃棒搅拌后，静置，使其自然沉淀，经12h后，倒去商泥上面的水，另换清水搅拌后，再让其自然沉淀，经30 mm后，再倒去上面的清水，另换清水，反复进行34次，直到污泥上面的水接近无色为止。F3. 3- 2 过滤倒去沉淀上面的清水，用金属筛过滤于
31、另一500mL锥形瓶中，弃去阻留在筛子上的泥渣。沉淀2030 min后，倒去沉淀上面的液体，另加新水，如此反复水洗23次，最后倒去上清液，将沉淀物倒入10 mL离心管中。经2500转/min离心3min后，倒去上清液。FJ. 3. 3 离心漂浮管内注入饱和氯化锅溶液，用玻璃棒搅匀后，离心3min，由于姻虫卵的相对密度小于饱和氯化纳溶液的相对密度，所以管内绝大多数的细虫卵均浮聚在液面(注意g加入氯化铺溶液量不得少于沉淀物的20倍)。F3. 3. 4 离心沉淀用毛细吸管反复吸取管中斜面上的浮膜于另一离心管中。加入清水，经搅匀后，再行离心，烟虫卵比水的相对密度大，因而下沉于管底。然后小心倒去上清液。
32、F3. 3- 5 蜻养注人23mL清水于管中，加几滴5%福尔马林溶液，置于2426C恒温箱中，培养1520夭。在培养过程中，渭水不得少于2mL。F3. 3. 6 镜检样品经培养1520天后取出，用毛细吸管吸去上面的渭水，余下含虫卵的沉淀物。在张干净的载玻片的中央滴一滴清水，用毛细吸管吸-小漓沉淀物于水中，涂匀后盖以盖玻片，在低倍镜下检查，必要时，再换以高倍镜。记录500个以上死、活虫卵数。查完一张片子而虫卵数不及500个时，依同法作第二张涂片检查。涂片不宜太厚，否则视野模糊不清，影响观察，一般涂片厚度能以透过涂片尚能辨认报纸上的字迹为宜。因为在适宜的温度和湿度下，经过1520天的培养.活虫卵就
33、会逐渐发育到幼虫期，而死虫卵则在同条件下仍然保持单细胞期或停留于某一发育阶段.故易于区别。415 G B 18466-2001 镜检时为达到较为快速而明显地辨认幼虫起见，可在载玻片上滴一滴预先配好避光保存的30%次氯酸纳溶液商品名为安替福明(antiformin)以代替清水作成涂片，置于显微镜下观察，可以看见被包在卵的最外层的蛋白质壳逐渐溶解，使卵内的幼虫一目了然。如遇沉淀物中沉渣较多、卵数较少时，可以直接注入几滴此脱壳液于离心管中，与沉淀物混合并搅匀之，而后吸一滴混合液子载玻片_1:.盖以盖玻片，直接镜检即可。此时视野格外清晰。在培养第1520天禾查见幼虫时，应继续培养30天(注意2加过30
34、%次氨酸饷溶液，不能再继续培养后再观察。.4 检验结果报告根据500个以上的蝠虫卵数，求出死卵的百分数，见式(Fl)。A=一旦一X100 m - n ) I Ei ( 式中:A蛐虫卵死亡率，%gm一一死亡蝴虫卵数;n 存活蚓虫卵数。附录G(标准的附录医疗机构污水和污泥申结核杆菌的检验方法G1 仪器和设备G 1.1 电炉。G1.2 恒温水浴箱。G1.3 高压蒸汽灭菌器。G1.4 滤菌器。G1.5 离心机。G1.6 恒温培养箱。G1.7 乙酸纤维膜g孔径为O.3O. 7m G1.8 玻璃漏斗G2，孔径为10-15mG1.9玻璃漏斗G4:孔径为34mG2 培养基和试剂G2.1 改良罗氏培养基G2.
35、1- 1 成分磷酸二氢何硫酸筷拘橡酸续谷氨酸纳甘油淀粉蒸馈水鸡蛋(包括蛋清和蛋黄)20%孔雀绿2.4 g O. 24日0.6 g 1. 2 g 12 mL 30 g 600 mL 1 000 mL 20 mL 416 GB 18466-, 2001 G2.1.2 制法将磷酸二氢愣、拘橡酸锅、味精、甘油及蒸馆水混合于烧杯内.放在沸水浴中加热溶解。加入淀粉继续加热1h.摇动使其榕解.待冷却至50C加人蛋液及孔雀绿，溶解，充分混匀。制成斜面.保持温度90 C.灭菌1h , G2.2 小川氏培养基G2. 2. 1 成分甲液:元水磷酸二氢御味精蒸惰水乙液:全蛋液甘油z%孔雀绿G2. 2. 2 制法1 g
36、 1 g 100 mL 200 mL 6 mL 6 mL 甲、乙两液混合分装试管内。制成斜面，保持温度90C灭菌1h。G2.3 pH为7.0的磷酸盐缓冲液(M/15)。G2.4 10%吐温(Tween)80水溶液加等量30%过氧化氢溶液。G2.5 4 %硫酸溶液。G3 检验程序G3.1 污水中结核杆菌的检验程序G 3. 1. 1 集菌根据检验室条件，可以选用滤膜集菌法和离心集菌法。滤膜集菌法:采用经煮沸消毒的乙酸纤维膜(孔径。30.7m)和特制的金属滤器，安装严密后，取污水样500mL拍滤，根据悬浮物的多少，一份水样需更换数张滤膜，将同一份水样滤膜集中于小烧杯内，用4%硫酸溶液反复冲洗，静置3
37、0min后，收集洗液于离心管中.3000转/min，离心30min，弃去ti青液，沉淀物中加1mL灭菌生理盐水混合均匀后，供接种用。离心集菌法g水样500mL.分装于50mL或200mL灭菌离心管中.3000转/min，离心30min。同份水样的沉淀物集中于试管内.加等量4%硫酸处理30min，供接种用。如体积过大，再次离心浓缩后接种。G3- 1.2 接种上述集菌液全部接种于改良罗氏培养基或接种于小川氏培养基上，每支培养管接种Q.1 mL 0 G 3- 1. 3 培养置37(恒温培养箱内，培养8J司.2周后开始观察结果，每周观察2次。分离菌株z在罗氏培养基t垦淡黄色或无色的粗糙型菌落，作抗酸染
38、色，阳性者作分离传代。分离传代古自株如生长速度在两周以上，则需作菌型鉴别;应用耐热触酶试验和传代精养于28C 培养21周观察是否生长，用此方法即可进行初步鉴别。G3.1.4 致病力试验耐热触酶反应阴性.28(不生长之菌落为可疑结核杆菌。于小白鼠尾静脉接种1mg商量(5mg/ mL前液，每只动物接种0.2mL).死亡时观察病变或8周后解剖脏器发现典型结核病变者可确认为检liifJ，核杆翩。其耐热触酶试验方法如下:取陷落35mg分散JO. 5 mL磷酸盐缓冲液中，置68(水浴中20min后取出，玲却后加吐温80和1过氧化每溶液混合液0.5mL。417 GB 18466-2001 发生气泡为阳性，3
39、0mm不产生气泡者为阴性。人型、牛型结核杆菌，胃分枝杆菌和海鱼分枝杆菌为阴性，其他非典型抗酸菌和非致病抗酸菌为阳性。人型、牛型结核杆菌在28C培养不生长，胃分校杆菌和海鱼分枝杆菌在28C培养能生长。G3.2 污泥中结核杆菌的检验程序G3. 2. 1 样品处理取污泥10g加100mL蒸馆水冲洗过滤(滤纸漏斗)，再经玻璃漏斗G2(孔径1O15m)和G4(孔径34m)抽滤，最后再经滤膜(孔径。.450. 7m)抽滤。取下滤膜，用4%硫酸3mL，充分振摇冲洗30 min. G3, 2. 2 取上述酸性菌液各0.1mL，分别接种于改良罗氏培养基或小川氏培养基上。以下操作步骤同污水中结核抨菌的检验程序。G4 检验结果报告综上所述，试验结果确证为结核杆菌者，可报告结核杆菌阳性。418
