1、中华人民共和国国家标准化核昔学试酸测定Chemical reagent 剂通则General rul四forthe determination of nucleotlde. 1 主题内容与适用范围GB/T 15356-94 本标准规定了化学试剂核背酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和干燥失重测定的通用方法。本标准适用于化学试剂核普酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用核苦酸及其衍生物的分析。2 511目标准GB/T 601 化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的哥哥备GB/T 602 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/t 613 化学
2、试剂比旋光度测定通用方法GB/T 617 化学试剂熔点范围测定通用方法GB/T 619化学试剂采样及验收规则GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 9008 液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法GB/T 9721 化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见部分3 一徽规定3. 1 本标准中所用的水、在没奋注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格。3.2 本标准中所用试剂的纯度应为分析纯。3. 3 本标准中凡层析测定时，核背酸R，值均应以在完全相同条件下的对照样品的R，值为判断标准，且每次测定都不得省去作为判断标准的对照样品。3. 4 本标准中凡层析测定需作杂质限
3、量检测时，应使用符合6.1.2.1条之规定的对照样品。4 熔点测定按GB/T617规定测定。核背酸的熔点数值可参考附录A(参考件)。5 比旋光度的测定按GB/T613之规定测定。核背酸的比旋光度数值可参考附录A(参考件)。国家技术监督局1994-12-22批准1995-10-01实施276 GB/T 15356-94 6 层析试验层析试验用于检测核苦酸的纯度及定性鉴别。所有核背酸均应以下列方法中选择-种方法进行测定.6. 1 纸层析6. 1. 1 方法原理纸层析法是以滤纸为惰性支持物的一种层析法.分离原理属分配层析的范畴，它利用不同榕质在静止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相
4、(I!P流动相两相溶剂的不断分配而达分离的目的。核背酸经层析后，常用比移值(R，)来表示各组分在层析谱中的位置(R，)值按式。)计算s式中gRf一一比移值#d.一一溶质迁移距离，cm;dm一一流动相迁移距离，cm。R d. -,- dm . ( 1 ) 在一定的条件下，同一核普酸的R，值是一定的.但由于影响R，值的因素较多，一般都采用与对照样品对比，即根据样品与对照样品在层析谱中R，值来进行鉴别，并可在254n曲的紫外灯下观察，以显示出杂质斑点的多少和色量来确定样品的纯度。也可剪下斑点，溶于特定溶剂，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算样品的含量和杂质的含量.6. 1. 2 试剂及材料6.1.2
5、.1 对照样品纸层析和薄层层析所用的对照样品，主体含量不少于98.0% 6.1.2.2 层析用纸层析用纸是指具有一定强度、质地均匀平整的纯棉浆制成的滤纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着纹理方向移动。定俭用的层析滤纸灰分须小于0.1%，一般可选用新华一号层析滤纸a6.1. 2.3 展开剂展开剂可参照附录B(参考件之规定，使用前制备。必要时可选用其他展开剂。6.1.2.4 展开室可选用大小适宜的标本缸。6. 1. 3 操作步骤取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔划一条直线，在直线两端2cm处开始点样，点与点之间距离为2cm，点样扩散的直径不超过0.5cmo同一张层析纸上可点鼓个样品，
6、纸的宽度取决于中羊品的数目，并留有点对照样品的位置.称取0.005g核昔酸样品，精确至O.000 1 g，癖于0.5mL水或盐酸溶液(c(HCl)=0.01 mol!LJ , 必要时稍微加热潜解。用微量进样楞或微量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不少于5L，即相当于50g祥晶.核苦酸纸层析-般采用上行，将已吹干后的层析纸两边卷成圃筒状，用二根塑料丝上下固定.在一高为36cm的标本缸内平放一培养皿，内盛高度为0.5cm的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱和蒸气平衡24h后，将样晶端朝下放入培养皿中，盖紧玻璃盖。展开1216h，流动相前沿即可上升2628 cm，此时将层析纸取出
7、晾干或在50C干燥。6. 1. 4 观察吸收斑点277 GB/T 15356-94 将除去展开剂后的层析纸，在254nm的紫外灯下观察，即观察出紫外吸收斑点。6. 1. 5 结果的确定6. 1. 5. 1 以50问点祥量，按规定展开并在紫外灯下观察，只观察出一个紫外吸收斑点，旦与对照样品的儿值一致，即可确定其层析试验为合格。6. 1.5.2 以50问点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，除显示出一个斑点外，其他核背酸的斑点小于或等于按产品规格制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他核背酸小于或等于标准。6.2 薄层层析6.2. 1 方法原理薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在
8、此薄层上进行色层分离的一种层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。6.2.2 试剂及材料6.2.2.1 对照样品应符合6.1.2.1条之规定。6. 2. 2. 2 硅胶GF本品系白色均匀细粉及萤光粉，粒度平均在1040m之间，含有约13%的半水合硫酸钙。本品应附合下列分离要求z各取0.040g工甲基黄、苏丹E、自在盼蓝，溶于100mL苯中。取2L.点样于按6. 2. 3. 1条之规定制备的硅胶GF板上，用苯展开10cm.色谱图应显示三个清晰的分离斑点，能盼蓝斑点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹E介于二者之间。6.2.2. 3 展开剂
9、通常选用正丁醇+丙盲目+冰乙酸+5%氨水+水=7+5+3+3+2(体积比)。必要时可选用其他展开剂。可参照附录B(参考件)或其他文献.6.2.3 操作步骤6. 2. 3. 1 制板制备薄层板所用的玻璃板必需表面光滑，清洁，其大小可根据需要选择.小的可用载玻片，大的可裁成20cmX20 Cm的玻璃片。取一定量的吸附剂(硅胶GF可按2530g加6065mL水)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为O.20. 3 mm的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。硅胶GF制板的时间从调成糊状到铺板不应超过1.5 min 市售的
10、预制板经6.2.2.2条试验，符合分离要求的，亦可使用。6. 2. 3. 2 点样和展层取薄层板一块，距底边1.5 cm处为基线点样，点与点之间的距离为1.5 cm，点样扩散的直径不超过O.2 cm，点与点之间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。称取O.004 g核背酸样品，精确至O.000 1 g.溶于0.2mL水或盐酸榕液(c(HCI)= O. 01 mol/口，必要时稍微加热溶解，用微量进样器或微量吸管点样，如要多次点样时，可用冷风将前一次点样吹干后，再点下一次样，点样量按检测要求不少于2L.即相当于20月样品，点样时必须注意勿损伤薄层表面。薄层层析可选用大小适宜的标本缸，将已点样的薄
11、层板平衡后，将样晶端朝下放入培养皿中，薄层板浸入展开剂的深度不超过O.5 cm，上行至流动相前沿离顶端。.51.0cm处(展开距离般在1520 cm)取出晾干，在50C干燥除去溶剂。6.2.4 观察吸收斑点JiY.符合6.1. 4条之规定。6.2.5 结果的确定成符合6.1.5.1及6.1. 5. 2条之规定。27 GB/T 15356-94 7 含量的测定按GB/T9721之规定，其中27. 1 测定条件波长z用样品所需的最大吸收波长，吸收池厚度:1 cm; 参比溶液g水或盐酸溶液(c(HCl)=0. 1 mol/L)或盐酸溶液(c(HCl)= O. 01 moI/L)。7.2 测定方法称取
12、10mg样品，精确至0.00001g.用盐酸标准溶液(c(HCl) = o. 1 mol/L)或盐酸标准溶液。但C)=0.01moI/L)溶解，转移至1000mL容量瓶中，稀释至J度，摇匀。接测定条件7.1条之规定，测定吸光度。7.3 结果的计算核背酸的含量按式(2)计算=一A/.M1000Z一., - - - X 100 . ( 2 ) 式中，X一一核背酸的质量百分含量，%; A一一核苦酸样品i在最大吸收波沃处的吸光度多一一核管酸样晶的摩尔吸收系数.L/cm moI , M 核苦酸样品的相)(j分子质量gb一一吸收池厚度，cm;C一一溶液浓度.mg/L，1 000 换算系数。8 干燥失重称取
13、0.1g样品，精确至O.000 1日。置于已在105士2(;干燥至恒重的称量瓶中.于105士2C的电烘箱中干燥至恒蠢。干燥失重按式(3)计算znu n l 2-m-二叫-m-z . ( 3 ) 式中，X一一干燥失重，%J m , 恒重前样品的质量.g，m，一一恒重后样品的质量.go279 中文名称腺曝岭核苦-5-磷酸(5-腺普酸)鸟啄玲核苦-5-确酸(5-鸟昔酸胞嘻睫核苦-5-磷酸(5-胞营酸尿嘈睫核背-5-磷酸(5-尿昔酸腺嚷岭核苦一5二磷酸(5腺昔二磷酸腺瞟岭核背-5二磷酸(5腺昔二确酸)腺嚓岭脱氧核背5磷酸(5腺螺岭脱氧核背酸)鸟瞟岭脱氧核背_5-磷酸(5鸟喋岭脱氧核昔酸)胞嘻睫脱氧核智
14、币，磷酸伍跑嗜睫脱氧核昔酸胸腺晴晓脱氧核背，确酸(5-胸腺嘈睫脱氧核普酸)电嚓岭核背-5-二磷酸( 5鸟普二磷酸)280 G/T 15356-94 附录A部分核苦酸的比旋光度、熔点和摩尔吸收系数(参考件)表Al英文名称相对比旋光度缩写)分于质量熔点.C川J? adenosine-5 -460-48 monophosphate 347.22 196-200 C5.lN NaOH (5-AMP) guanosine-5 -monophosphate 363.24 190-200 d (5-GMP) cytidine-S -+27.1 monophosphate 323.20 233 d CO. 5
15、.H,O (5-CMP) uridine-S -monophosphate 324. 19 198.5 (5-UMP) adenosine-S -diphosph且te(5- 427.21 ADP) adenosine-S -triphosphate (5-507.19 ATP) adenine deoxyri-38.0 bose-5 -phos-331.22 phate(5-dAMP) CO. 2.H,O guanine deoxyri-31. 0 bose-5 -phos-347.23 phate白-dGMP)CO. 4.H,O cytosine deoxyri-+38.5 bose-5
16、-phos- 307.20 183-184 phate (5 -dCMP) C1. 2.H,O thymidine-S -4.40 phosphate ( 5-322. 21 175 dTMP) C4.H，O guanosine-5 -diphosphate (5-443.21 GDP) 摩尔吸收系数，L/cm mol pH 捕.nm血XIO2 257 15. 1 1 256 12. 2 2 280 13. 2 2 262 10.0 2 257 15.0 z 257 14.7 2 258 14.8 1 255 11. 8 1. 5 279 13.0 7 267 9.6 l 256 12.3 G
17、/T 15356-94 续表A1中文名称英文名称相对比旋光度熔点.C(缩写分子质量JO鸟醺岭核苦-5-三磷酸guanosine?5L triphosphate (5-(5鸟苦二磷酸)523. 19 GTPl 胞噜晓核背-5二磷酸cytidine-5 -diphosphate (5-(5 -胞背二磷酸403.18 CDPl 胞嗜睫核管-5二磷酸cytidine-5 -(5胞普二磷酸triphosphate (5- 483.16 CTPl 尿嘻睫核营-5二磷酸uridine-5 -diphosphate (5-(5尿昔二磷酸)404.17 UDPl 尿嘈睫核苦-5二磷酸uridine-5 -(5尿
18、苦二确酸)triphosphate (5- 484. 15 UTPl 腺曝岭核营-3, 5环式adenosine-3 , 5-一磷酸cyclic- 329.21 monophosphate 注，() d代表达到熔点后分解.附录B常用被曹酸展开剂的组成和配比表(参考件表B1IftJ 配比展开(体积比异丁酸+0.5moI/L氨水5+3 异丙醇+浓氨水+水7+1+2 95%乙醇+1moljL乙酸销7+3 用氨水将水调节pH至pH10正丁醇+冰乙酸+水5+2+3 正丁醇+丙嗣+冰乙酸+5%氨水+水7+5+3十3+2摩尔吸收系数，L/cm mol pH 且.nm卢mX10 1 256 12.4 2 280 12. 8 2 280 12.8 2 262 10.0 2 262 10.0 2 256 14.5 说明纸层析常用展开剂纸层析常用展开剂纸层析常用展开剂纸层析常用展开剂薄层层析常用展开剂薄层层析常用展开剂281 GB/T 15356-. 94 附加说明g本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由北京化学试剂总厂归口。本标准由上海丽珠东风生物技术有限公司负责起草。本标准主要起草人何光珍、金承德。282
