1、GB/T 18420.2-2001 前言本标准是与GB18420.1-2001(海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级相配套的标准。本标准的附录A、附录B、附录C为标准的附录。本标准的附录D、附录E为提示的附录。本标准由国家海洋局提出并负责解释。本标准由国家海洋标准计量中心归口。本标准起草单位国家海洋局南海分局、广东省实验动物监测所。本标准起草人z黄韧、杨丰华、吴进孝、薛成、程树军、魏社林、徐梅春。333 中华人民共和国国家标准海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法G/T 18420. 2-2001 iological toxicity insp四tionmethod for pollutant
2、from marine petroleurn exploration and exploitation 1 范固本标准规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排入海洋的部分污染物在不同海区的生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、试验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。本标准适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排入海洋的钻井泥浆、钻屑和生产水的生物毒性检验。本标准中规定的方法在适当调整试验条件后亦适用于本标准限定外的其他海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所
3、有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB 17378.3-1998海洋监测规范第3部分z样品采集、贮存与运输GB 17378.4-1998海洋监测规范第4部分海水分析GB 17378.7-1998 海洋监测规范第7部分:近海污染生态调查和生物监测GB 18420.1 2001 海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级3 定义本标准采用下列定义z3. 1 生物毒性检验biological toxicity inspection 见GB18420.1-2001。3. 2 96 h换水式生物毒性试验96 h renewal biological toxi口tytest 在
4、96h的试验期间内每隔一定时间部分更换或全部更换试验溶液，进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验。3. 3 无可见影响浓度NOEC(no-observed-effectconcentration) 指试验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一段时间后，通过观察试验生物的不良影响，并比较试验组与对照组统计分析结果，判定出对试验生物无显著影响的最大浓度。4 原理海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响，通过观察测定试验生物在96h试验条件下接触试验物质后的异常或死亡效应，J得到海洋石油勘探开发污染物对试验生物有明显影响的具体浓度。中华人民共和回国家质量监督检验检瘦总局2001-08-28批准2002- 0
5、3-01实施334 5 采祥、送样和样晶保存5. 1 样品的采集5. 1. 1 采样数量GB/T 18420.2-2001 采样数量应足够供3次重复试验的朋量。油基泥浆5L.7j(基泥浆5L.钻屑5kg.生产水排放口采5 Lo 5. 1. 2 采祥地点5.1.2.1 钻井泥浆经振动筛分离后的泥浆应从排放口或泥浆池采集。5.1.2.2钻屑经振动筛分离后采样。5.1.2.3生产水在生产水的排放口采样。5.2 包装和运输5. 2. 1 包装采送样品必须用惰性材料制成的塑料容器密封包装。5.2.2 运输必须符合GB17378.3有关样品贮存与运输的规定，样品必须在48h内送达生物毒性实验室。生产水样品
6、必须在4C8C保存。5.2.3标签所有样品容器上应标明样品名称、采样油井号、生产或使用者、采样人、采样时间、采样方式、采样数量等。i样品送达实验室后送样人要填写送样表，样品接受人应检查样品标签和包装是否完整，并对样品进行编号、签字和记录存档。5.2.4 贮存生产水样品必须保存在4C8C.其他样晶必须保存在阴凉处，并在样品送达实验室后的24h内开始试验。6 试验生物和标准毒物6. 1 试验生物6. 1. 1 种类下列试验生物只需选用一种。6.1.1.1 对虾仔虾2中国对虾(Penaeuschinensis)、斑节对虾(Penaeusmonodo川、长毛对虾CPenaeuspeniciJ1atus
7、)。6.1.1.2 卤虫(Artemiidae)幼体。6.1.2试验生物开始试验日龄6.1.2.1 对虾小于仔虾期10d(PlO期)的仔虾。6. 1-2.2 卤虫z虫卵孵化20h24 h后的幼体。6.2 标准毒物本试验所用标准毒物为分析纯的十二烧基磺酸销(sod川ndodecyl sulfate .SOS)。7 设施和设备7. 1 设施7. 1. 1 饲养试验生物的水池或水族箱等。7.1.2 可控照明装置。7. 1. 3 维持试验生物的控温、充氧、循环清洁海水的设备.包括制冷和加热的恒温设备、充气设备、循环33 : 水设备、水过滤设备等。7.2 试验容器GB/T 18420.2-2001 7.
8、 2. 1 对虾仔虾试验用1000 mL烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。7. 2.2 卤虫无节幼体试验用40mL50 mL的烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。7.3 环境因子测定的试剂和仪器7. 3. 1 按GB17378.4第27、30、32章要求的试剂或仪器。? 3. 2 除7.3. 1要求外，可选用的试剂和仪器包括经校正的普通混度计、精密试纸等。7.4 其他搅拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网等。8 试验环境和安全注意事项8. 1 试验室环境必须干净、无污染，避免人为的影响因素。8. 2 试验人员必须作好安全防护措施，如配备工作服，一次性手套等。9 试验程序9. 1 试验生物来源、饲养和选择
9、9. 1. 1 对虾仔虾9.1.1.1 来源从虾茵厂购入或生物毒性实验室自繁饲养。9.1.1.2 饲养对虾仔虾饲养的适宜条件见表10购人的仔虾必须在实验室理11养48h后才可用于毒性试验，自繁饲养的仔虾必须在试验开始前24h从饲养室移入实验室。表1仔虾试验室饲养条件饲养条件中国对虾仔虾斑节对虾仔虾长毛对虾仔虾温度.r2225 , 2729 26-29 盐度2533 2833 2530 pH 7. 68. 2 7. 68. 2 7.68.2 9.1.2 卤虫幼体9.1.2.1 卤虫卵来源从商场购入或实验室自繁收集。9.1.2.2 卤虫卵孵化取19卤虫卵加人1L稀释水中，在25.C、盐度3035、
10、光照2000 lx3 000 lx 的环境条件下充氧孵化，取同一批次孵出的无节幼体放入稀释水中经20h24 h饲养后，选择消化道形成后的幼体用于毒性试验。9. 1. 3 合格的试验生物9.1.3.1 健康、正常的试验生物，24h内死亡率小于10%。9.1.3.2 试验生物的24h标准毒物敏感试验的毒性结果必需与其他批次试验生物的敏感范围一致。9.2 稀释水的准备使用人工海水作为稀释水，盐度30，pH(7.9土O.2)，溶解氧接近饱和。用作稀释水的人工海水配方必须经试验生物饲养试验，证明其对试验生物的生长发育无明显影响或是已经普遍使用的人工海水配方。9. 3 贮备液的配制9. 3. 1 泥浆贮备
11、液的配制9. 3. 1.1 油基泥浆按体积比取1份泥浆加入9份稀释水，2000 r/min3 000 r/min搅拌15h至絮状，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层混悬液作为贮备液。9. 3. 1.2 水基泥浆按体积比取l份泥浆加人9份稀释水，2000 r/min3 000 r/min搅拌15min，然日加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层II悬液作为贮备液。336 GB/T 18420. 22001 9.3.2 钻屑贮备液的配置9. 3. 2. 1 油基泥浆钻屑取一定质量的钻屑加入稀释水中.2000 r/min3 000
12、r/min搅拌15h.取上层混悬液作为贮备液，试验前充分搅拌。贮备液浓度小于100000mg/Lo 9. 3. 2. 2 水基泥浆钻屑贮备液的准备同水基泥浆。9. 3. 3 生产水贮备液的配制取一定体积的生产水加入稀释水中.2000r/min搅拌15min 配制成预定浓度的贮备液。9. 4 预备试验9. 4. 1 选取4组5组等比或等问距浓度，如1.10.100.1000mg/L及对照组，设2个4个重复样，每个容器放5个生物进行试验，以确定全部死亡和存活的浓度范围。温度、pH、自军解氧要求与驯养条件一致，每24h观察记录死亡率，及时取出死亡生物。如试验结果不能确立正式试验液浓度范围则需要重新选
13、择浓度并重复预备试验。9.4.2 在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，预备试验浓度可在大于毒性容许值设置等距浓度。9.5 正式试验9. 5. 1 试验浓度设置9.5.1.1 在预备试验设定的浓度范围内，设定5个等对数间距或等比浓度组和1个对照组，建议采用的等对数间距为1.1.35.1.8.2. 4.3. 2.4. 2.5. 6.7. 5等及其10的各次方倍数，等比的稀释因子为0.5。如需计算LC值，试验浓度应包括元死亡和全部死亡的浓度，用以得到至少三个连续的死亡浓度。每个试验浓度至少4个重复样。每个容器包括10个生物体。9.5.1.2 在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，如试验
14、生物预备试验的LC远大于毒性容许值，则可在大于容许值的区间选择等问距浓度。9.5.2 试验生物移人9.5.2.1 对虾仔虾用手抄网在驯养池中随机选择试验生物并及时放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验操作过程中，应在30min内完成分放试验生物。9. 5. 2. 2 卤虫幼体用胶头滴管在型11养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移人试验容器。应在30min 内完成分放试验生物。9. 5. 3 试验溶液更新每24h准备新的试验溶液，然后从对照组开始，由低浓度到高浓度试验组逐级移入存活的试验生物。9.5.4 充气要求当试验溶液的溶解氧浓度小于60%的饱和度，必须对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为
15、60个/min100个/mino如试验组进行充气，同样对照组也需进行充气。9.5.5 试验的环境因子试验适宜的环境为温度23C28C.盐度2833.pH7.68. 2.试验过程中温度变化范围不超过2 C .盐度变化范围不超过2.pH值变化范围不超过0.409. 5. 6 饲喂9.5.6.1 对虾仔虾喂卤虫无节幼体50个/d0 9.5.6.2 卤虫幼体饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂，应避免加入藻液引起试验溶液体积的明显改变。9.5.7 观察和记录每24h观察试验生物两次并记录异常行为，尽快移去试验生物的死亡个体。试验生物存活数记录在原始记录表内，见附录AC标准的附录)。9. 6 环
16、境因子的测定和记录337 GB/T 18420. 2-2001 每次试验溶液配制后和试验溶液更新前必须测量并记录各项环境因子，如溶解氧、pH值、温度、盐度等。测定方法参照GB17378.4中第27、30、32章的有关规定，另外可选用校正后的普通温度计测定水温以及选用精密试纸测定pH值。测定值记录在96h换水式生物毒性试验原始记录表上，见附录A(标准的附录)。9. 7 试验生物死亡判定试验生物体色变成不透明，轻触元反应或在显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。10 试验结果分析和判定10. 1 结果的有效性试验溶液的溶解氧必须达到60%饱和度以上，对照组的死亡率不超过10%.理11养生物24h
17、的LCco和同一实验室其他批次同种生物的试验结果相符。10.2 试验结果的判定生物毒性的试验结果判定见附录C(标准的附录)。10.2.1 在大子或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现试验生物死亡，直接判定为大于生物毒性容许值。10.2.2 在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现试验生物死亡，对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，如符合正态检验和方差齐次检验则采用附录D(提示的附录)的参数检验方法(Dunnetts检验)判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验则采用附录D(提示的附录)的非参数秩检验方法(Steel s多对一检验)判定NOEC值，以NOEC值来判定是否符合生物毒性容许值。10
18、. 2. 3 当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现生物死亡，并且有一组的死亡率为100%时，可通过图表法或概率法计算LC;o值。图表法直接判定是否符合生物毒性容许值，概率计算法计算置信区间，以置信上限是否大于毒性容许值为判定限。96hLC;o的概率计算法见附录E(提示的附录)。11 质量控制11. 1 批间和批内质量控制11. 1. 1 每批次试验必须同时进行标准毒物的24h生物毒性试验，通过比较1.，(./0值评价试验生物质量的稳定性。11.1.2 保证试验过程试验环境因子的一致性，即试验期间的温度变化不超过2C .盐度变化不超过2.pH变化范围不超过0.4.溶解氧大于60%的饱和度。11.
19、 2 原始记录原始记录应完整。包括:采样和试验的时间、地点g样品的保存方法g采样和试验人员签名;试验所用的方法和技术g质量控制记录$试验的原始资料，仪器校准和维修记录;试验报告等。12 检验报告检验报告包括检验报告表和试验报告。12.1 检验报告表检验报告表包括:送样单位、送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、试验结果和依据GB18420. 1-2001对试验结果判定的结论、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式见附录B(标准的附录入12.2 试验报告试验报告包括试验物质的化学性质和其他材料g稀释水，贮备液，和试验溶液的配制;试验动物驯养和负荷
20、数g对照组死亡数和标准物质LCso的生物数据;用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度和试验牛物反应的关系。338 。国4斗品M口MMDD4项目对照组试验组1试验组2时间(开始/结束)A B C D A B C D A B C D 存活温度o h24 h 盐度pH DO 记最存活温度24 h48 h 盐度pH 以】记录存活温度48h72h 盐度pH 00 记录存活温度盐度72 h96 h -pH )() 记录川WU凶。Amc 。国时，品NDNNDD斗项目试验组3试验组4试验组5时间(开始/结束A B C D A B C D A B C D 存活温度o h21 h 盐度pH 00 记录存活温度24 h
21、48 h 盐度pH 00 记录存活温度48 h72 h 盐度pH 00 记录存活温度盐度72 h96 h pH 00 记录GB/T 18420. 22001 附录B(标准的附录)生物毒性撞验报告襄表B1生物毒性检验报告表No: 共页第页产品编号名称产品出厂日期样品接受生产单位受检单位委托人委托单位来样方式样品编号采样地点果样日期采样方式样品保存方式采样样品数量抽样基数检验类别试验日期试验生物物种试验生物日龄检验依据检验结论检验室z(签章)年月曰备注批准g审核=汇核341 GB!T 18420. 22001 附录C标准的附录生物毒性试验结果判定流程图在小于毒性军事许值吾结果判定试验组生物出现死亡
22、是攫率卦析E事检瞌否是LCso的计算方整齐性撞撞否是95%置信阻Ounnett s撞骗Steel、事时幢幢幢蜡果判定NOEC值的确直图Cl试验生物存活的假设检验死亡率是两组斟上死亡否是苦两组死亡图章法草LC值卡方检验是是最低陆度和最高撞度死否亡为0和100%概率计算法是Spearman-karber植瞌ill1 式中，X , 对照组的平均存活率;X , 第1试验组的平均存活率gSw 平均值的方根$n, 对照组的重复祥gn, 试验组的重复样。表03t值计算表污染物浓度.g/L丁Et, . 25 2 0.570 2. 5 3 2.058 5. 0 4 3. 766 D1.5方差分析T介值表(见表0
23、4)使用举例。当=0.05时，查表04可知t，值为2.42。那么乌2. 42从而判定NOEC为2.5%。表04方差分析(Dunnetts test)T介值表O. 05单侧检验v/n 1 2 3 4 5 6 5 2.02 2.44 2.68 2.85 2.98 3.08 6 . 94 2. 34 2.56 2. 71 2.83 2.92 7 . 89 2.27 2. 48 2.62 2.73 2.82 8 . 86 2. 22 2. 42 2.55 2. 66 2.74 9 . 86 2. 18 2.37 2.50 2.60 2. 68 10 . 83 2. 15 2.25 2.47 2. 56
24、 2.64 11 . 81 2. 13 2. 24 2.44 2. 53 2. 60 12 . 80 2.11 2. 23 2. 41 2.50 2. 58 D2 Steel s多对一秩检验Steels many-one rank test D2.1 原理和适用范围Steel s检验将各试验组和浓度组编秩后，通过比较各浓度组和对照组的秩和来判定两者之间是否有统计学的差异。本分析方法造用于毒性试验的原始数据不符合正态检验和方差齐次检验后的数据分析。D2.2 分析步骤D2. 2. 1 把一组96h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和标准离差列表.见表050D2. 2. 2 把
25、每个对照组和试验组的数据进行合并s然后将对照组和每个试验组的数据从小到大排序，统一编秩(1，2，)。当数据相同时，秩次取位置序数的平均值g最后把所有排序结果列表，并计算每个试验浓度组的秩和。见表06秩计算表。:H GB/T 18420. 2 - 2001 D2. 2. 3 本例检验水平为O.05，试验组数(除对照组)为4，查表07，T.二10，只有1个试验组的秩和值等于T.而其余试验组的秩和值均大于丸，所以本例中NOEC为10%。符合生物毒性容许值。表05平均值和标准离差计算表重复样对照组1. 8% 3.2% 5.6% 10% 原始数据A 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 0.8 B 。
26、1. 0 1. 0 1. 0 O. 8 C 。O. 9 1. 0 1. 0 O. 7 D 1. 0 1。1. 0 0.8 O. 6 反正弦方根变换1. 412 1. 412 1. 412 1. 112 1. 107 1. 412 1. 412 1. 412 1. 412 1. 107 1. 112 1. 412 1. 412 1. 412 O. 991 1. 412 1. 249 1. 412 1. 107 0.886 平均值离差组数1. 412 1. 371 1. 412 1. 336 1. 023 0.0 1. 412 。Il. 023 0.011 1 2 3 4 5 表06秩计算表重复样
27、对照组1. 8% 3.2% 5.6% 10% A 1.412(5 ,5 , 5 ,3.5) 1. 412(5) 1. 412(5) 1. 412(5) 1. 107(3.5) B 1.412(5.5.5.3.5) 1. 412(5) 1. 412(5) 1. 412(5) 1. 107(3. 5) C 1. 412(4.5.5.2) 1. 249(1) 1. 112(5) 1. 112(5) 0.991 (2) D 1. 412(5 , 5 ,3.1) 1. 412(5) 1. 412(5) 1. 107(3) 0.886 (1 ) 秩和19 20 18 10 表07T介值表试验组数(不包括对
28、照组)重复样2 3 4 5 6 7 8 9 4 11 10 10 10 10 5 18 17 17 16 16 16 16 15 6 27 26 25 25 24 24 24 23 7 37 36 35 35 34 34 33 33 8 49 48 47 46 46 45 45 44 9 63 62 61 60 59 59 58 58 10 79 77 76 75 74 74 73 72 11 97 95 93 92 91 90 90 89 12 116 114 112 111 110 109 108 108 附录E(提示的附录)96 hLC50的概率计算法E1 把一组试验的原始数据进行浓度对
29、数转换、死亡率查表转换为概率单位。见表El计算表。345 GB/T 18420. 2-2001 表El汁算表浓度1%浓度对数X试验生物数n死亡数r死亡率/%概率单位1. 35 0.130 3 40 12 30 4.48 1. 8 0.255 3 40 24 60 5. 25 2. 4 O. 380 2 40 28 70 5. 52 3. 2 0.505 1 40 36 90 6.28 4. 2 0.623 2 40 40 100 对照40 。E2 把浓度对数作为横轴，死亡概率作为纵轴作坐标图，见图El。在图中标出概率5的浓度对数，logLC，=0.24.求反对数，得).74%。E3 求浓度-反
30、应的回归方程7 6.5 6 5.5 5 4.5 4 0.2 0.3 0.4 0.5 死亡概率线性死亡概率图El浓度对数和死亡概率单位关系图E3. 1 在直线取距离较远的两个点，如取概率单位4(y，)和6(Y2)然后在图中读出相应的x，=0.035 和.T2=0.445.代人式(El)，计算斜率bb = (Y2 - y ,) / (x2 - .T,) = 4. 878 ( El ) E 3. 2 将b值和LogLC50值代人式但2): y=y十以.r- X) = 3.829 + 4. 878 ( E2 ) 式中:Y试验组的期望概率单位;Y一一概率单位5, Z一概率单位为y时的浓度对数gX 概率单
31、位为5时的浓度对数。E4 x检验x检验的公式2式中!n-一试验生物数;r 死亡数;户期望死亡率，%;叩一期望死亡数。x二二(r-np)/(n户口p) . . . . . ( E3 ) 列出回归线的t检验表，见表E20本例自由度为2.查表得zjmz599，而回归线的x二).335 9.所以回归线符合检验。346 z r 0.130 3 40 12 O. 255 3 40 24 O. 380 2 40 28 O. 505 1 40 36 x E5 求logLC的标准误差E5.1 求标准差SE5.2 求标准误差Sm标准误差公式:GB/T 18420. 22001 表E2回归线的x2检验表y p ，在
32、pr-n户4. 464 9 29 1. 6 0.4 5. 074 2 53 2, 2 2.8 5. 683 9 75 30 2 6. 293 2 90 36 。szt=om (r-n户)2np (l-p) (r np )2 np(l 1内O. 16 8.236 O. 019 4 7.84 9.964 0.786 8 4 7.5 O. 533 3 。O. 1 。. 339 5 ( E4 ) z一旦一=0.026 5 . . . . . ( E5 ) (n /2) 式中n一一计算标准差范围内的试验动物数，本例中为概率46所用的动物数。E6 求LCso的置信限logLC的95%的置信限=logLC土1.96XSm=0. 188 1 O. 291 9 求反对数得LC的置信限=1.5419%-1. 9583%。347
