1、ICS 65.020.20 B 05 中华人民共和国国家标准GB/T 20497-2006 进口牧草草坪草疫情监测规程2006-09-19发布Guidelines for quarantine surveillance on imported forage and turfgrass seeds 2007-03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局也舍中国国家标准化管理委员会战叩GB/T 20497-2006 前-EH 本标准的附录A为规范性附录，附录B、附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部种植业管理司归口。本标准主要起草单位z全国农业技术推广服务中心
2、。本标准参加起草单位：内蒙古自治区植保植检站、贵州省植保植检站和天津市植保植检站。本标准主要起草人2王春林、林芙蓉、赵美琦、郭静敏、夏忠敏、李秀文。GB/T 20497-2006 进口牧草草坪草疫情监测规程1 范围本标准适用于所有国（境）外进口牧草、草坪草种子进境检疫放行后在境内种植期间的疫情监测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 疲情监测pest surveillance 通过调查、检测或其他程序确定有害生物发生或不存在的官方过程。2.2 隔寓isolation 利用人为的或自然的条件将进口的种苗与外界或某些植物分隔开，以免有害生物相互传染或侵害。2. 3 隔离试种监测is
3、olation surveillance 国外引进的种子、苗木等繁殖材料离开口岸后在隔离检疫场或隔离试种区内，在隔离条件下进行试种，经过生长期间的观察和相应的检测、检验，以确证是否带有监测有害生物的一种检疫措施。2.4 隔离检疫场（圃）isolation qu盯antine 四tablishment由检疫部门设立或认可的、具备一定隔离设备和有害生物检验设备的专门设施，承担从境外引进种苗的隔离试种检疫任务。2.5 隔离试种区isolation quarantine area 由检疫部门核定的具备一定自然隔离条件的区域，一般用于较大量的生产性引种的隔离试种。2.6 常规疫惰监扭Uroutine p
4、est surveillance 对经有害生物风险分析危险性较低、大量引进的植物种苗在国内种植期间进行的危险性有害生物调查和检测。3 监测的有害生物3. 1 高粱瘦蚊Cont盯iniasorghicola (Coquillett) 3.2 三叶草斑潜蝇(Liriornyza trifolii Burgess) 3.3 茵稽广肩小蜂(Brurhephagusoddigus Sekovlii) 3.4 鳞球茎茎线虫Ditylenchus dipsaci (Ktihn) Filipjev 3.5 剪股颖粒线虫Anguina agrostis ( Steinbuch) Filipjev 3.6 小麦矮
5、腥黑粉菌(Tilletia controversa Kuhn) 3. 7 小麦印度腥黑粉菌( Tilletia indica Mitra) 3.8 黑麦草腥黑粉菌 Tilletia飞wlkeri( Castlebury et Carris) GB/T 20497-2006 3. 9 禾草腥黑粉菌(Tilletia fusca Ell. et Ev.) 3. 10 酋稽黄萎病菌(Verticillium alba atrum Reinke et Berth. ) 3. 11 茵稽萎焉病菌 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus(McCulloch)
6、 Davis et al 3. 12 黑高粱(Sorghum almum Parodi) 3. 13 假高粱Sorghum hale户ense( L. ) Pers. 3. 14 莞丝子属(Cuscuta spp. ) 3. 15 检疫审批单中提出的其他有害生物。4 疫惰监测4. 1 执行主体进口种苗种植地省级植物检疫机构或由省级植物检疫机构委托的当地植物检疫机构。4.2 监测时间对禾本科牧草、草坪草，一般监测时间为两个生长季，对首宿、车轴草等豆科牧草须连续监测2年3年。4. 3 隔离试种监测4. 3. 1 监测对象首次引进或者经风险评估属于高、中风险，在引进种子、苗木检疫审批单中要求进行隔离
7、试种检疫的种子、苗木及其他繁殖材料。4.3.2 隔离场所检疫机构设立或认可的，具备隔离条件的场所。4.3.3 隔离试种监测程序（见固1)4. 3. 3. 1 送检根据检疫机构审批要求，由引种单位（个人）将进口的植物种苗送到指定的隔离场所进行隔离检疫。4.3.3.2初检植物检疫隔离场（圃）工作人员对报检材料进行开包检查和检验，核对植物种类，初步检查是否有有害生物污染，有污染则进行除害处理，所有包装材料必须焚烧。4.3.3.3 盆栽对初检未发现有害生物污染的材料栽植于苗床中，并在隔离检疫温室中培养。4.3.3.4 生长期检查对禾本科牧草、草坪草，分别在苗期、分冀期、开花期和成熟期进行症状观察；对豆
8、科牧草、草坪草，分别在苗期、生长中期、开花期进行症状观察。发现症状及时取样进行实验室检测，发现限定有害生物污染则进行除害处理。发现其他可疑有害生物则需进行有害生物风险分析，高风险者需进行除害处理。4.3. 3.5 疲情监视j报告根据监测结果出具“引进种茵入境后疫情监测报告”（格式见附录Al，检疫合格的报告单作为引种单位（个人）再次引进相同植物品种的依据。4.4 常规疫情监测4. 4. 1 监测对象吾风险较低GB/T 20497-2006 虚线以上为隔离试种场程序否有害生物风险分析风险较高图1瘦情监测流程固经风险评估属于低风险，在引进种子、苗木检疫审批单中要求进行集中种植或不限种植条件的引进种子
9、、苗木或其他繁殖材料。4.4.2 监测方式对于要求集中种植的，则每批次必须进行监测；对于不限种植条件的，则根据本地区该作物引种种植情况，进行重点抽查。GB/T 20497-2006 4.4.3 常规疫惰监测i程序（见固1)4. 4. 3. 1 报检进口种苗种植后，引种单位（个人）应及时向检疫部门提出疫情监测申请，必要时，出具引进种子、菌木检疫审批单复印件，并说明种植的时间、地点和面积。4.4.3.2 生长期检查检疫部门对引进种苗进行生长期的病虫害监测。对禾本科牧草、草坪草，分别在苗期、分囊期和l次2次刘割后进行症状观察；对豆科牧草、草坪草，分别在苗期、生长中期及第一次刘割前进行症状观察。发现症
10、状及时取样进行实验室检测，发现监测的有害生物污染则进行除害处理。发现其他可疑有害生物则须进行有害生物风险分析，检疫机构根据风险分析的结果采取相应的措施。有害生物田间调查方法及危害状识别参见附录B。有害生物实验室检验方法参见附录C4.4.3.3 疫惰监测报告根据监测结果出具“引进种苗入境后疫情监测报告”（格式见附录A），检疫合格的报告单作为引种单位再次引进相同植物品种的依据。5 疫情处理5. 1 报告制度疫情监测过程中发现本规程监测的有害生物，应该立即逐级上报，5. 2 封锁控制发现疫情应立即采取封锁控制措施，小面积隔离试种应立即销毁，大面积分散种植应视情况进行销毁或喷药控制，并封存处理未播种子
11、。4 GB/T 20497 2006 附录A（规范性附录51世t种古自入槐JS蓝情监测报告号i种单位：耳其旦在人1耳其果电谈：审批单佼g审批iii编号，审批数量重g植物名称s品种名称：种苗来源国（地区）引进数量种极地点$种极丽粉、3种锁日盟国s!iii扮有害处物名单（中文名和学者）瘦情监测结果s1.发现危险性有寄生物及危害程度2.发现可疑有害生物及危害程度处理意见：！.符合国家检疫婆求，人境后检疫合格。2.发现戒防做葡1害性物，绘处螺t处燃:II；附后），然续城楼年，不宜再次号1液。1发现危险性有害生物，对圭部种苗作销毁处理。4.其他处现f意见：份楼实施单位（销物被授守用激）专职检疫员（簇字）
12、年月日注：丰报告一式三联，第一联交引种单位，作为再次引进同种菌的依据之一，第二联由检疫实施单位国存，第二耳提交检疫审批单佼GB/T 20497-2006 附录B（资料性附录）进口牧草草坪草监测的高害生物田间调查及危害状识别B.1 田间调查取样方法采取逐块踏查基础上，对疑有发生的点片有针对性地调查，未发现可疑对象的采取棋盘式调查方法，0.33 hm （即5亩）以下的地块取点数不少于10点；0.33 hm2 1. 33 hm2 （即5亩20亩）的地块取点数不少于15点儿33hm2 3. 33 hm2 （即20亩50亩）的地块取点数不少于20点；3.33 hm （即50窗）以上的地块取点数不少于25
13、点；每点面积为0.5 m2 1. 0 m2 o B. 2 田间危害状识别B. 2. 1 寓粱瘦蚊Contarinia sorghicola ( Coquillett) J 危害高粱（Sorghumculgaris Pers. ）、苏丹草Sorghumsudanense (Piper) Stapf。幼虫在穗内危害，受害穗多枯萎发红，造成瘪粒、批粒。B. 2. 2 三叶草斑潜蝇（Liriomyzatrifolii Burgess) 危害白车轴草（Trifoliumrepens Linn. ）、红军轴草（Trifolium pratense Linn.）和紫茵稽（Medicago satha Lin
14、n ）。主要是幼虫危害。幼虫潜入叶片和叶梗，取食后形成的取食痕为白色小刻点，直径为0.13 mm 0.15 mm。潜道通常为白色带有潮湿的黑斑和干燥的褐色区域。这些坑道典型的症状是蛇形，紧密盘绕，形态不规则，随着幼虫的成熟，坑道变宽。成虫的产卵痕较小（0.05 mm且更均匀圆滑）。B. 2. 3 盲稽广肩小蜂（Bruehe phagus roddigus Sakovlii) 危害酋稽属（MedicagoLinn ）、紫云英（Astragalussinicus Linn. ）及其他豆科牧草。种英上有许多小圆孔，在一个种英内常有1个4个种粒被寄生。正常健康的籽粒饱满而带绿色，被害种子呈黄褐色，外表
15、多皱裙，略鼓起。受害轻者不能发芽，重者仅剩一空壳。成虫体形微小，在田间不易被发觉。B. 2. 4 鳞球茎茎线虫Ditylenchusdipsaci (Kuhn) Filipjev 危害剪股颖属（Agrostis Linn. ）、羊茅属（Festuca Irn.）、早熟禾（P“annuLinn.）、黑麦草(Lolium perenne Linn. ）。寄主表现矮化、畸形、节间膨大、分囊增加，严重时整株死亡。B. 2. 5 剪股颖粒线虫Anguinaagrostis (Steinbuch) Filip，ev危害禾本科牧草、草坪草。受侵染的寄主植物在幼苗阶段并不表现明显的症状，只在花穗期表现典型症状
16、，主要表现为被寄生的小花的颖片、外秤和内秤显著增长，分别达正常长度的2倍3倍、5倍8倍和4倍，其内的子房转变成雪茄状的虫瘦。虫瘦开始形成时绿色，后期呈紫褐色，长4mm 5 mm，而正常颖果的长度仅1mm左右。B. 2. 6 小麦矮腥黑粉茵（Tilletia controversa Kuhn) 该病菌在牧草、草坪草上很难自然发病。B. 2. 7 小麦印度腥黑粉菌（Tilletia indica Mitra) 该病菌可侵染黑麦草（Loliumperenne Im）和多花黑麦草（Lolium multiflorum Linn. ），但苗期一般不表现症状。B. 2. 8 黑麦草腥黑粉菌Tilletia
17、walkeri ( Castlebury et Carris) J 该病菌可侵染黑麦草属（LoliumLinn），但苗期一般不表现症状，成熟后籽粒变成菌瘦。B. 2. 9 禾草腥黑粉菌（Tilletiafusca Ell. et Ev.) 危害禾本科牧草、草坪草。GB/T 20497-2006 感病的羊茅属（FestucaLinn. ）植株矮化花序、小花都变短，较易识别，黑色的病粒在颖片内很明显，并从内外秤问突出，不易脱落，而健株种子成熟后很快脱落。感病的雀麦属（Bromus Linn. ）与健株难区分，最显著的特点是花絮稍紧密，小穗变宽，病粒包裹在内外秤之中很饱满，而健株种子较细长。B. 2
18、. 10 茵蓓黄萎病菌（Verticilliumalbo-atrum Reinke et Berth. ) 危害百稽属（Med旧1goLinn.）、红豆草（Onobrychisviciaefolia Scop.）、沙打旺（Astragalusad surgens Pall. k百脉根（Lotuscorniultus Linn. ）。发病初期叶片由叶尖和叶缘开始变黄或稍带紫色，常由叶尖向下形成“V”字形褪绿斑，植株上部叶片往往沿中脉向上对折，逐渐整个叶片黄化或呈紫红色，直至于枯；植株的节间及叶腋部的分校缩短，使病株矮化而紧簇，病株常仅为健株高度的二分之至三分之二g病株花色变淡，甚至不开花；严重时
19、整株枯死。表现上述症状病株的根、茎、叶柄和花柄的剖面均可见维管束变色。依病害发生严重程度的不同，维管束可呈黄色至深褐色，这是该病最重要的症状识别特征。草层密集或湿度大时，枯死的病茎表面可被一层灰白色霉层（病菌的分生袍子梗或分生袍子）。B. 2. 11 酋宿萎菁病Clavibactermichiganensis subsp. insidiosus(McCulloch)Davis et al 危害首稽属（MedicagoLinn. ）、百脉根（Lotu.1 corniculatus Linn. ）、白香草木樨（Melilotusalbus Desr. ）及车轴草属（Trifolium repens
20、 Linn. ）。该病在秋季首稽收割后，再生植株达5cm 10 cm时症状最明显。轻度发病叶片呈斑驳状，叶片边缘向上卷曲，植株略变矮，中度症状为茎丛生；严重发病时，植株矮化，株高仅几个厘米，茎细，叶小而厚，通常畸形，边缘或全叶褪色，植株萎焉而死亡。病株主根的横切面，外围维管组织、先呈黄褐色，随病害发展，整个中柱呈黄褐色（健株的中柱为白色）。病根皮层内表面常有变色的侵染点。B. 2. 12 黑高粱（Sorghumalmum Parodi) 适生于温暖潮湿的亚热带地区。多年生草本。植株高大，株高2m3m左右，光滑元毛，茎直径约5mm 6 mm，具匍匍根状茎。叶片宽线形，长30cm 80 cm，宽2
21、cm 5 cm，基部有白色绢状毛，中脉白色且厚，圆锥花序开展，长约40 cm，淡红色至紫黑色；主轴粗糙，分校轮生。小穗孪生，一枚有柄，另一枚无柄，有柄者为雄性或退化不育，元柄小穗两性，能结实。结实小穗呈披针形，中部较宽，籽粒较短，颖果通常稍短于颖片至使小穗顶端略呈锐尖。小穗长5mm，宽2.5 mm左右，厚1.8 mm左右。颖硬革质，黄褐色、红褐色，大多显紫黑色，表面平滑，有光泽。秤片膜质透明，具芒或无芒。颖果卵形或椭圆形，栗色至淡黄色。小穗成熟后，大多小穗从穗轴节问折断，此为折断分离，脱落小穗下部易带留穗轴节段，折断处不整齐，脱落后小穗腹面常具被折断的小穗轴1或2枚。极少小穗成熟后自关节脱落，
22、脱落处不整齐，脱落后小穗腹面常具1或2枚有关节的小穗轴，也表明黑高粱及假高粱小穗形态及小穗成熟后脱落的差别。B. 2. 13 假高粱Sorghumhalepense (L.) Pers. J 适生于温暖潮湿的亚热带地区。多年生草本。茎杆直立，高1m3m，直径为0.5 cm 1 cm，具匍甸根状茎。叶阔线状披针形，长25 cm 80 cm，基部被有白色绢状疏柔毛，中脉白色且厚，叶舌长l.5mm1.8 mm，具缘毛。圆锥花序直立，大而松散，长20cm 50 Cffi0淡紫色至深紫色，主轴粗糙，分校轮生。穗轴节间易断裂，常随小穗脱落。小穗多数成对着生，无芒。一有柄，一无柄，有柄者多为雄性或退化不育，
23、无柄小穗两性，能结实，顶生小穗3枚共生，有柄小穗2个，无柄小穗1个。结实小穗呈卵圆状披针形，两个颖片革质，船形，近等长，黄褐色、红褐色至紫黑褐色，表面平滑，有光泽，基部边缘及顶部二分之一具纤毛；秤片膜质透明，具芒，芒从外秤先端裂齿间伸出，膝曲扭转，极易断落，有时无芒。结实小，穗成熟后自关节自然脱落，脱落处整齐，颖果（种子）倒卵形或椭圆形，红褐色或棕褐色，表面无光泽，顶端钝圆，具宿存花柱。脐圆形，深紫褐色。胚椭圆形，大而明显，长为颖果的二分之一至三分之一。由于颖果（种子）及穗节间极易断裂GB/T 20497-2006 脱落，所以种子成熟季节，很难见到完整的假高粱穗。B.2. 14 莞丝子属（Cu
24、scuta spp. ) 莞丝子多生于地边、路旁、河边、草丛中，为恶性杂草。与寄主争夺水分、养分和同化物，同时与寄主争夺阳光，致使寄主生长不良，降低产量与品质，甚至成片死亡。荒丝子为农作物病虫害提供中间寄主，助长病虫害发生，具有顽强的适应性和可塑性，一旦传入，极难根除。苑丝子属主要靠寄生于草本植物或木本植物上生活。茎丝状，缠绕在寄主上，通过吸器来吸取其自身所需营养；叶退化成鳞状，花小，大多数为簇生，聚伞花序，合莓，5茎数，有时为3或4茎数。花被、雄草草下位，雄葱着生在花冠筒的喉部，鳞片具流苏或有绒毛，大多着生于基部相对雄霉的部位，子房2室，每室有2个倒生的胚珠。花柱分离或联合，柱头头状或线形伸
25、长。萌果不开裂或不规则开裂或在基部线状周裂。种子l粒4粒，胚在肉质胚肉中，线状，成圆盘形弯曲或螺旋状，无子叶或稀具细小的鳞片状遗痕。8 GB/T 20497-2006 附录C（资料性附录）进口牧草草坪草监测的有害生物实验室检验C.1 高粱瘦蚊Contariniasorghicola (Coquillett) J 卵z极细小，棒锤状，长0.15 mm，白色至桶黄色，基部有一短柄。幼虫2成熟幼虫体长1.5 mm，宽0.5 mm，初孵幼虫为灰白色，后渐转为粉红色，愈长大颜色愈深，将要化踊时变为楠红色。体呈圆筒状，两端微尖，前端有一黑色口器。最后一次脱皮后显出胸叉骨（剑骨）。休眠幼虫体外有薄丝茧，茧略
26、呈椭圆形，泥褐色。蜗z初时为均匀红色，近羽化时，头部及附肢变为黑色，位于柔软泥褐色的袋状物中，成围蝠，形似亚麻籽。成虫：体细小，长约2mm，雌虫略大于雄虫。头小，复眼黑色，连接成连拱形。下顿须4节，偶因第2节愈合减为3节。触角淡褐色，丝状，由14节组成。雌虫触角长度仅为体长一半，第5节最短，粗壮，似圆柱形，基部膨大部分的长度为其直径的2.5倍。顶节在其基部的二分之一处有凹缆，端部的三分之一处膨大而末端呈狭圆。雄虫触角长度等于体长，鞭节为双结形（具2个几乎相等的结节，每个节上具有一个环丝）。第5节基柄的长度为其宽度的1.5倍。端节基部膨大近球形。颜面黄色，胸部楠红色，中胸背板中央、横贯侧板的斑点
27、以及腹板的膨大部分均为黑色。翅灰色透明，稀生细毛，后缘的毛较长，沿翅脉并生有鳞片。纵脉共4条，前缘脉淡褐色，第3脉到达翅外顶角附近，第5脉约在外端三分之一处分2叉，无横脉。足细长，基节部延伸，附节共5节，第1附节明显短于第2附节；爪的构造简单，爪细长高度弯曲，略长于爪垫。雌虫产卵器细长，显成针形，其长度（当完全伸出时）长于体长，端部具有一对细长瓣状物，其长度为其宽度的5倍。雄虫外生殖器的背片和腹片皆作深裂2叶；背片较宽凹缘宽而呈三角形，叶阔圆。c. 2 三叶草斑潜蝇（Liriomyzatrifolii Burgess) 卵，(0. 2 mm 0.3 mm(0. 10 mm 0. 15 mm）大
28、小，米色且稍透明。幼虫元头姐，完全成熟时长达3mm。初龄幼虫刚羽化时无色，后变为浅橙黄色。末龄幼虫为橙黄色。幼虫（和蜗有1对后胸气门，形态如兰面锥体。每个后胸气门有3个孔，有1个孔位于三面锥体的顶端。蜗z蜗呈卵形，腹部稍扁平，0.3 mm 2. 3 mm)(0. 5 mm 0. 75 mm）大小，蜗颜色变化很大，从浅橙黄色到棕色。成虫成虫小，黑灰色，身体粗壮，1.3 mm 2. 3 mm长，翅长1.3 mm 2. 3 mm。雌虫较雄虫稍大。检索表的初步鉴定zA内外顶鬓均着生于黄色区域. -B 至少顶鬓均着生于黄色区域. - . c B中胸盾片主要为黑色，但略带粗灰色区域gMH，脉末端长是次末端
29、的近2倍；蜗后气门每侧有7个12个孔突番茄斑潜蝇L.bryomae 中胸盾片明显粗糙，灰黑色；113，脉末端是次末端的3倍4倍；蜗后气门每侧有3个孔突三叶草斑潜蝇L.trifdll c. M4脉末端长是次末端长的3倍4倍$腿节主要为鲜黄色；蜗后气门每侧有3个孔突美洲斑潜蝇Lsativae M3+，脉末端长是次末端长的2.5倍；腿节黄色，部分棕色或黑色，甚至全部黑色；蜗后气门每侧GB/T 20497-2006 有6个12个孔突.E拉美斑潜蝇L.huidobrens口c. 3 首稽广肩小蜂（Bruchephagusroddigus Sakovlii) 雌蜂体长1.3 mm 1. 8 mm，黑色。头
30、比胸部稍宽，颊长，几乎与复眼纵径等长，额上面稍凹陷。触角索节呈棒形，具浓密绒毛，5节，棒节3节。并胸腹节中部具细网纹，在基部具有不多且短的皱裙。腹部腹面平坦，最后一节背板不向上扬起。雄蜂个体较小。C.4 鳞球茎茎线虫Ditylenchusdipsaci (Kiihn) Fili时ev将种子用浅盘法或贝尔曼漏斗法进行线虫分离，或采取水中解剖法，即将种子解剖后浸在水中，挑取游离在水中的线虫，于20倍镜下观察分离的结果。若发现分离到线虫，转到800倍显微镜下，进一步进行种的鉴定。测计值2雌虫：L=l.Omm 2. 2 mm,a=3664,h二6.512，1120,c二36,V=7678，口针长度为J
31、Om 13 m, 雄虫：L二1.0 mm 1. 9 mm,a二3774,h=615，1219，口针长度约10m 12 m，交合刺长度在23m 28 m之间。(L虫体全长川体长最大体宽；b体长头端至食道与肠结合处距离，c体长尾长；c尾长月工门或泻殖腔处体宽；V阴门至头顶距离100体长）形态描述z首先用热力将线虫杀死，以便观察和描述。虫体侧区刻线4条。头部无环纹。口针针锥长度约占口针总长度的一半，基部球圆球形。中食道球内肌肉发达，约有4m 5 m厚。食道基部球分叉或覆盖肠的前端几微米。排泄孔位于狭部或食道腺后部的相应位置。雌虫的后阴子宫囊约为脏阴距的一半或略长。雄虫泄殖腔的交合伞包裹尾部的四分之三
32、长。交合刺长23m 28 m，尾圆锥形，末端常呈指状。C.5 剪股颖粒线虫Anguinaagrosti (Steinbuch) Filipjev J 一旦发现可疑的虫瘦，可将其浸泡于加水的小皿中直接镜检2龄幼虫。2龄幼虫z除生殖系统未发育和虫体较小外，其余形态结构似成虫。自不同寄主分离的剪股颖粒线虫的雌虫、雄虫和2龄幼虫的测量值见表CL 表C.l 剪股颖粒线虫雌虫、雄虫和2龄幼虫的测量值剪股颖属（Agro;ti;Linn. ) 早熟禾（Paaann皿Linn.）和寄主虫态假梯牧草Phleumphleoide; (Linn ) Karot. 雌虫雄虫2龄幼虫雌虫雄虫2龄幼虫L/mm I 39 2
33、.60 I 05 I 45 0. 55 0.82 2 54 4. 14 I. 54 2 31 0 81 I. 25 13. 8 25.4 23. 830.。4 7. 2 65.0 21. 8 30. 7 21. 6 34.4 43 5 71. 0 b 12. 6 28 7 6 5 8.9 3. 2 4.5 10.3 26.5 6 8 11 6 4. 0 6. I 25. 2 43.0 21. 5 28 4 11 720 0 28.8 48.8 20 4 32 7 12 I 15.4 v 87 92 90 92 口针m10 12 10 12 10 10 12 10 12 10 交合刺m25 32
34、 30 37 引带m10 13 13 15 10 GB/T 20497-2006 雌虫虫体粗壮，经热杀死后腹卷成螺旋形。角质膜表面细环纹化。侧带区在发育成熟的虫体上难于观察。唇低平，维缩。食道典型的垫刃型：前体部圆柱形，中部略膨大，与中食道球连接处微缝缩；峡部短而窄；后食道球发达，梨形，非明显叶状，不覆盖或微覆盖肠端。前生殖管发达卵巢常折叠2次，卵母细胞围绕一中柱着生，多列；授精囊长梨形，与输卵管缝缩分开，子宫中常有多颗卵同时存在。后生殖管退化成后阴子宫囊，延伸至阴门虹门间的一半距离处，内充满精子。尾锥形，尾端锐尖。雄虫虫体较雌虫短而细，经热力杀死后一般呈弓形，偶尔近直形。精巢常回折1次，精母
35、细胞多列。交合刺纤细，近端部微腹折或缺腹折。引带细线形。交合伞亚端生。尾端锐尖。c. 6 小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kiihn）、小麦印度腥黑粉菌（Tilletia indica Mitra）、黑麦草腥黑粉菌Tilletiawalkeri (Castlebury et Carris) J和未草腥黑粉菌（Tilletiafuea Ell, et Ev.) c. 6. 1 洗涤检验此方法可用于未发现菌瘦情况下的小麦矮腥黑粉菌、小麦印度腥黑粉菌、黑麦草腥黑粉菌、禾草腥黑粉菌、光腥黑粉菌和网腥黑粉菌的区别检验。c. 6. 1. 1 步骤将每份样品按四分法提取两份试验样品
36、，每份JQg0 将10g试样倒入灭菌三角瓶内，加元菌水100mL，再加表面活性剂CO.I%吐温20)1滴2滴，加塞后在振荡器上振荡5min，然后将悬浮液倾入50mL的灭菌离心管内，以1000 r/min离心5min，弃上清液，再加适量无菌水悬浮沉淀物并合并悬浮物于10 mL离心管中，再以1000 r/min离心5min, 弃上清液。加灭菌水悬浮沉淀物，视沉淀物多少，定容至lmL 2 mL0用灭菌吸管吸取悬浮液滴于灭菌玻片上，制片镜检。每个样品全片检查5个玻片。应以油镜(1000倍）检测成熟于包子各种指标，目尺要精确核校。在鉴定腥黑粉菌冬泡子时，每个样品必须测量25个30个抱子，测量参数有袍子大
37、小、外胞壁结构、网纹有元、网目大小、网脊高度、胶质稍厚度、不孕细胞大小、颜色等。c. 6. 1. 2 结果判定光腥黑粉菌2外胞壁光滑。印度腥黑粉菌z外胞壁疵状突起，于包子个体大，通常直径不小于28m，不孕胞常呈泪珠状。黑麦草腥黑粉菌：外胞壁钝圆状突起，但子直径28.9 m 43. 7 m，胶销厚1.7 m 6. 7m, 禾草腥黑粉菌2外胞壁网纹状，网目宽1m 4. 1 m，网脊高1.5 m；于包子直径18m 32 m（平均23m) ；胶鞠元或小于1m, 矮腥黑粉菌z外胞壁网纹状，网目宽3.5 m 6 m，网脊高1.5 m 3 m；袍子直径16m 25 m；胶销元色半透明，厚2m 4 rn。网腥
38、黑粉菌2外胞壁网纹状，网目宽2rn 4 rn，网脊高0.5 rn 1. 5 rn；胶销无色半透明，厚小于1.5 fllio c. 6. 2 冬袍子萌发鉴定本方法可用于鉴别发现菌瘦后区别矮腥黑粉菌、网腥黑粉菌和禾草腥黑粉菌。c. 6. 2. 1 步骤将冬于包子团块置于灭菌凹玻片上，加灭菌水数滴，用玻棒轻轻研碎成糊状物，然后用灭菌的I，型玻棒将它均匀涂布于3%水琼脂培养基平板上，密度以显微镜低倍视野不超过40个60个于包子为宜。然后分别在5、弱光照（450 Ix上下），以及1517、弱光照或黑暗条件下恒温培养。第l次检查可在培养10d后进行，以后每隔3d 7 d再行检查。试验时先注意菌瘦老化后，抱
39、子萌发始期推迟，萌发率较低。c. 6. 2. 2 结果判定矮腥黑粉菌冬于包子在5下至少3周开始萌发，有的甚至在第5周以后；1517下不萌发。11 GB/T 20497-2006 印度腥黑粉菌冬于包子5C以下不萌发，1517萌发。网腥黑粉菌冬于包子5下约经2周萌发；1517下经7d 10 d萌发。禾草腥黑粉菌冬于包子5下约2周开始萌发，3周萌发最多；1517下不萌发。C. 6. 3 PCR检测本方法可用于鉴别小麦印度腥黑粉菌和黑麦草腥黑粉菌。c. 6. 3. 1 步骤c. 6. 3. 1. 1 黑麦草样晶中冬抱子的分离和培养取50g黑麦草种子样品，加200mL灭菌水，加一滴吐温20(Tween
40、20），振荡3min，洗涤液经48 m和20m网筛过滤，截留物冲洗液I000 r/min离心3min，去上清。冬于包子用0.5%次氯酸销（NaClO)表面消毒，2%琼脂平板上20培养7d，取单个萌发抱子转入PDA培养基，20培养3d，取菌丝块转入PDB培养基中20，108r/min振荡培养10d，离心收集菌丝备用。c. 6. 3. 1. 2 菌丝DNA提取c. 6. 3. 1. 2. 1 在研钵中用细砂磨碎冻干菌丝（或在液氮中磨碎新鲜菌丝）。c. 6. 3. 1. 2. 2 粉状菌丝（30mg 60 mg ）转入小管，加500L TES (100 mmol/L Tris, pH8. O, JO
41、 mmol/L EDTA,2%SD凹，加50g 100 g蛋白酶K,5560孵育0.5 h I h，期间轻轻摇动混匀。c. 6. 3. 1. 2. 3 调节盐浓度至I.4 mol/L（用5mol/L的氯化纳140L)，加1/10体积（65L) 10% CTAB,6510 min, c. 6. 3. 1. 2. 4 1体积SEVAG（氯仿十异戊醇24 + 1) ( 700 L)轻摇混匀，0孵育30min,4C 12 000 r/min离心10min, c. 6. 3. 1. 2. 5 取上清至I.5 mL管，加225L 5 mol/L乙酸氨（NH,AC）或300L 3 mol/L乙酸锅CNaAC
42、），轻摇混匀，置冰上30min以上（越长越好），412000 r/min离心10min。c. 6. 3. 1. 2. 6 取上清，加入3L RNA酶（5U/ mL )37孵育15min。c. 6. 3. 1. 2. 7 加0.55体积异丙醇（510Ll沉淀DNA，立即12000 r/min离心5min，如元DNA团出现，立即置样品于冰上15min 30 min c. 6. 3. 1. 2. 8 弃上清，冷70%乙醇洗21次干燥后溶解于50L TE中eC. 6. 3. 1. 3 PCR扩增反应总体积50L，包含,IOmmol/L Tris HC1;50 mmol/L氯化饵（KCl,pH8.3);
43、 I. 5 mmol/L氯化筷（MgCl2); dA TP, dGTP, dCTP, dTTP浓度为250mol/L；引物浓度100nmol/L; 10 ng20口g模板DNA;0. 5单位T叫DNA聚合酶。反应循环程序为94C3 min;9430 s 6345 s 7245 s 35个循环，最后72延伸7min，扩增程序为943min;9430 s 58l min,72C 1 min,35个循环g最后72延伸7min, PCR扩增片段在I.5%琼脂糖凝胶0.5 TBE缓冲液中电泳分析，EB染色。引物序列2Tin7, 5 GTT TGA GCC ACG CTA TGA CC 3 Tin8,5
44、GGC TCA TCT ACG CAT ACG TT扩Tin3,5 CAA TGT TGG CGT GGC GGC GC 3 Tin4,5 CAA CTC CAG TGA TGG CTC CG 3 C.6.3.2 结果判定Tin7 /Tin8能扩增Tilletiat吃1lkeri( Castlebury et Carris），得到39lbp的产物片段，而不能扩增Tilletia indica M山a;Tin3/Tin4能扩增Tilletiaindica Mitra，得到415bp的产物片段，而不能扩增Tilletiawalkeri (Castlebury et Carris）。12 GB/T
45、20497-2006 c. 7 茵宿黄萎病菌Verticilliumalbo咱trumReinke et Berth. c. 7. 1 步骤截取lcm的带病茎段，用3%5%次氯酸销表面消毒后进行培养，挑取病原菌显微镜下观察。(1）在PDA平板培养基上于25条件下培养，产生大量白色气生菌丝，1周后由白色变成乳白色，2周3周后为褐色并在菌落中央生成黑色的休眠菌丝（背面）。另外还有白色的扇变体产生。分别于培养7d、14d和21d后观察菌丝形态。(2）在PLYA培养基（梅干煎汁培养基）或Christen选择性培养基平板上22下培养14d左右。根据菌落特点和分离菌形态进行鉴定，必要时可挑取病原菌镜检。茵
46、稽黄菱病菌的菌落有暗色休眠菌丝体形成的辐射状结构。PLYA培养基配方：梅干煎汁100mL、酵母浸膏1g、乳糖5g、琼脂30g、蒸馆水900mL。制备梅干煎汁时，将50g梅干切成小片，在100mL水中煮沸30min，梅干渣淳榨出汁液后弃去，煎汁调至pH5. 8 6. 00 Christen选择性培养基配方z在1000 mL蒸馆水中加入L山梨糖2g、L天门冬素2g、磷酸氢二饵(K2HPO,)l g、氯化梆（KCl)O.5 g、硫酸续（MgSO, 7H20l 0. 5日、乙二钱四乙酸铁饷盐（FeNa-ED TA)0.01 g、75%五氯硝基苯lg（有效成分）、牛胆汁。.5 g、棚酸纳（NaB,O,
47、lOH20)1 g、链霉素。.3 g，高压灭菌后pH调至5.7 0 c. 7. 2 结果判定首稽黄萎病菌丝形态特征z菌丝直径2m 4 m，无色。分生子包子梗分隔，直立，侧向分校；初次分枝两出、三出或互生，二次分校轮生，顶层小梗基部膨大而顶端细尖g每节轮生2个7个小梗，一般有2轮4轮，并有一个顶枝。分生袍子单生，单细胞或有一横隔，椭圆形、卵形或梭形，无色或略带褐色，湿润时可在小梗顶端聚成头状，干燥时分散。第一次形成的分生袍子大小为（6 m 12 m ) (2. 5 m 3 m），后来产生的分生于国子（特别是在培养上）明显的小，为（3 m 6 m) X (2 m 3 m）。后期产生少量黑色的休眠菌
48、丝，大小为2.8 m 6. 7 m。c. 8 盲稽萎藉病菌Clavibactermichiganensis subsp. insidiosus(McCulloch)Davis et al 在改良Burkholder琼脂培养基（含250L/L的放线菌隅）上分离，20培养5d 7 d后观察典型菌落。菌落一般为淡黄色，圆形，边缘光滑，有光泽，略隆起或扁平。大多数菌株在7d 14 d后，产生典型的蓝黑色颗粒状色素，即可作为鉴定的特征性指标。选取典型菌落悬浮于50L 100 L蒸馆水，在金氏B培养基上划线，2022培养5d 7 d 观察产生色素情况。改良Burkholder琼脂培养基配方z蛋白陈（peptone沾自，磷酸二氢何（KH,PO,)o. 5 g；磷酸氢二饵CK2HPO, )2 g，硫酸续（MgS0,)62mg，氯化铿0元1)5白，酵母
