1、ICS 65160X 85 圆雪中华人民共和国国家标准GBT 243 1 02009烟草及烟草制品 转基因检测方法Tobacco and tobacco products-Detecting method of genetically modified organism contents2009-09-30发布 200912-01实施丰瞀髁鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会促111GBT 243 102009目 次前言ll范围l2规范性引用文件13术语和定义l4实验室要求z5试剂36仪器设备37取样48烟叶样品DNA提取方法。49转基因烟草定性检测方法510转基因烟草定量检测“711转基
2、因烟草检测验证标准。812检测报告。9附录A(规范性附录)含EB电泳液的处理方法。10附录B(规范性附录)各类样品的DNA提取方法11附录C(规范性附录)DNA提取物的浓度和纯度的测定方法12附录D(规范性附录)烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件13附录E(规范性附录)溶液的配制。14附录F(规范性附录)荧光定量PCR扩增体系与扩增条件16附录G(资料性附录)烟草转基因检测结果报告单18前 言GBT 24310一2009本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G为资料性附录。本标准由国家烟草专卖局提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会(SACTC 144)归
3、口。本标准起草单位：中国烟草进出口烟叶检测站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭兆奎、陈枝南、冯茜、万秀清、颜培强、李丽杰、乔婵、孙宏宇。1范围烟草及烟草制品 转基因检测方法GBT 243102009本标准规定了烟草种子、鲜烟叶、初烤烟、片烟和卷烟烟丝进行转基因成分检测的样品取样方法和实验室检测方法。本标准适用于烟草及烟草制品转基因成分检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期
4、的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 56061卷烟第1部分：抽样GBT 19616烟草成批原料取样的一般原则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31转基因烟草genetically modified tobacco通过基因工程技术或现代生物技术改变基因组构成的烟草。32小样increment在一个取样单位一次取出的一定数量的烟草，构成单样的一部分。GBT 19616 2004，定义2633样品sample从一个群体中选取的一个或多个具有代表性的样本单位。34实验室样品laboratory sample用于实验室检验或测试的样品，其代表总样。GBT 19616 2004，定义2103
5、5检测样品test sample实验室样品经过研磨和匀浆(如果需要)处理后进行分析测定的样品。36聚合酶链式反应扩增polymerase chain reaction amplificationPCR扩增模板DNA序列在含有4种脱氧核糖核酸(dNTPs)、引物、DNA聚合酶等的反应体系中，在仪器中通过多次的高温变性、退火和延伸的循环过程，最终使目标DNA片段以几何倍数扩增。】GBT 24310200937巢式PCR nested PCRPCR扩增过程中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。38半巢式PCR s
6、embnted PCRPCR扩增过程中，首先用一对外引物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物DNA傲为模板，使用该模板DNA序列内部的一个引物及第一轮扩增中的一条外引物进行第二次PCR扩增。39实时定量PCR扩增realtime PCR amplification在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。310看家基因housekeeping gene细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而且必不可少的组成型表达基因。311阳性对照样品positive control sample经鉴定为含有检测目标成分
7、的对照烟草样品。312阴性对照样品negative control sample经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。313试剂对照样品reagent control sample检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。3。14提取空白对照样品extraction blank control sample样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品。315特异性specificity特异地检测某种物质，并可将其与相似物质、杂质或降解物分辨开来的能力。4实验室要求41样品重复检测每个待测样品随机分成两份，每份单独进行DNA提取和PCR分析。42对照样品每次试验中均设置阳
8、性对照、阴性对照、试剂对照及提取空白对照。在定性检测时选用01阳性作为阳性对照；定量检测时设置01、05、1o、2o、5o oA阳性对照建立标准曲线。43防止污染样品准备、样品前处理、DNA提取、PCR反应液加样、PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作在相互隔离并具有100外排风的不同操作间中进行，并设置紫外灯，操作前后进行空间过夜照射。样品研磨在强力通风橱中进行，每个样品更换一次塑料手套；样品的称量应设专用天平，不可在称量试剂的天平室内进行；用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都应进行灭菌处理，tip头和各种离心管一次性使用。2GBT 24310200944安全防护整个试验操作过程中必须穿
9、着工作服和佩戴手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。45有毒废弃物处理451含EB的电泳液处理方法见附录A。452含EB的凝胶含有EB的废凝胶暂存于广口瓶中，定期放人生物危害焚烧炉中进行焚烧处理。5试剂除非特别说明，检测中仅使用分析纯化学试剂和超纯去离子水，PCR反应体系用水应使用电阻率为182 Mncm以上的超纯水。各种缓冲液均冷藏于4冰箱，各种酶和抗生素母液冻存于一20以下冰箱。51 十二烷基硫酸钠(sDs)。52 乙二胺四乙酸钠(EDTA)。53十六烷基-Z甲基一乙基一溴化铵(CTAB)。54 Tris碱。55 Tris-HCl。56聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。57液氮。58三
10、氯甲烷。59异戊醇。510 2一巯基乙醇。511乙醇。512硼酸。513氢氧化钠。514琼脂糖。515溴酚蓝。516二甲苯青FF。517溴乙锭。518冰醋酸。519溴乙锭(EB)。520 NaCl。521 MgCl2。522 DNA聚合酶。523 10XPCR缓冲液。524尿嘧啶DNA糖基酶(uNG酶)。525 dNTPs液(dATP、dCTP、dGTP各25 mmolL，dUTP 5 mmolL)。526 DNA标准分子量。527限制性内切酶(Xmnl、EcoR V、NsiI)。528 SYBR Gteen I染料。6仪器设备61 PCR仪(控温精度士03)。3GBT 24310一20096
11、2紫外分光光度计(波长精度03 nm)。63荧光定量PCR仪(控温精度士04)。64电泳系统(50 V600 V，10 mA400 mA)。65紫外分析仪(检测灵敏度：Proteino02 ng DNAo05 ng)。66恒温水浴锅(精度土01)。67高速冷冻离心机(最大离心力30 0009)。68微量离心机(最大离心力20 0009)。69 pH计(精度002 pH或士2 mA)。610分析天平(感量0000 1 g)。611超低温冰箱(一40一86)。612 微量移液器(10 pL、20 pL、50 pL、100 pL、200 ItL、1 000弘L，精度o810)。613超纯水器(电阻率
12、182 Mncm)。614磁力搅拌器(转速02 000 rrain)。615超净工作台截流效率：99999 9，层流风速：045 ms(90 fpm)。616恒温干燥箱(30300，温度波动士1，控温精度士1)。7取样71种子以品种和种子产地为取样单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但供种单位(种子产地来源)不同，也作为单一样品取样，每一样品随机多点取样10 g，样品编号注明品种名称、种子产地。72鲜烟叶鲜烟叶样品在田间取样，以品种和种子产地为取样单位随机取样，每个样品在10个不同地块各取一个嫩芽或叶片，编号注明品种名称、种子来源、取样地点、取样单位、取样人、日期等信息，自然失水2
13、d后放人塑料袋中。73初烤烟以检验批为单位，每检验批的产地和等级应是相同的，50件以下随机选2件各取1个小样，5l件100件取4个小样，101件150件取5个小样，151件200件取6个小样，200件以上每增50件(不足50件按50件计)增取1个小样，各小样混合后用四分法缩分出均匀样品2份(每份250 g)作实验室样品供检验和复检，实验室样品应密封并填写标签，注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。74片烟对于已装箱的片烟，以箱(内装100 kg烟叶)为取样单位，用长筒状取样器，每箱随机取约2 g烟叶，将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200 g烟叶作为一个检测样品；也可在复烤加工车间，结合水分
14、测定取样，注明烟叶产地、等级和箱号、取样地点、送样单位和取样人。75卷烟按照GBT 56061中规定的方法进行卷烟抽样。8烟叶样品DNA提取方法81样品前处理811种子随机取烟草种子样品放人装有滤纸保湿的培养皿中，28光照下培养7 d，用滤纸吸出表面水分，称种子萌发幼苗质量约900 mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，分别装入3个已知质量的15 mL离心管中，再称量，置-20冰箱中储存备用。4GBT 243102009812鲜烟叶随机取鲜叶样品约900 mg，在研钵内加液氮(57)研磨成粉末，转入称量的3个15 mL离心管中，称量确定叶片组织质量。813烤后烟叶随机取烟叶样品约20 g，用硫
15、酸纸包好，置方盘加盖后，40恒温干燥箱(616)中过夜使其干燥，在灭菌的研钵中研成粉末，存于20 mL离心管中，从中取约60 mg分别放入两个15 mL离心管中。814卷烟随机取卷烟50支，去除卷烟纸、滤嘴，将烟丝按81-3方法前处理。82 DNA提取方法见附录B。83 DNA产量和纯度测定方法见附录c。9转基因烟草定性检测方法首先进行共有序列标志的PCR扩增，再通过巢式PCR、限制性内切酶酶切和目的基因序列扩增方法进行验证，确定所转目的基因的种类。91共有序列标志的PCR扩增911 PCR引物用于转基因烟草检测共有标志主要有：花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌rlOS终止子和编码卡那霉素
16、抗性基因(NPTII)，根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测。9111 35S启动子序列扩增35S-1：5CTACAAATGCCATCATTGCG 335S-2：5GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3该引物的扩增片段长度为205bp，作为转基因烟草检测的标志，确定花椰菜花叶病毒35S启动子序列的存在。9112 IIOS终止子序列扩增NOS_1：5GATTGAATCCTGTTGCCGGT一3NOS_2 1 5GTAACATAGATGACACCGCG一3该引物的扩增片段长度为213bp，作为转基因烟草检测的标志，确定来自根癌农杆菌的终止子序列nos的存在。9113 NPTII
17、基因序列扩增NPT一1 15GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC一3NPT-2 15GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA一3该引物的扩增片段长度为411bp，作为转基因烟草检测的标志，确定卡那霉素抗性基因NPTII序列的存在。912 PCR扩增体系见附录D。913 PCR扩增条件见附录D。914电泳及凝胶观察称琼脂糖(514)溶于05倍TBE缓冲液(第E10章)中，制成15凝胶，加EB(05 pgmL)，待温度降至55左右时倒入放有梳子的凝胶模具中，冷凝后拔出梳子。放入水平电泳槽中，取10 pL扩增产物加溴酚蓝上样缓冲液(第E1l章)点样，加DNA标准分子量标记
18、(526)电泳(64)，紫外分析仪(65)观察电泳结果。5GBT 24310200992特异性基因序列的PCR检测在烟草上进行过转基因研究的主要有烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-cp)、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMVcp)、马铃薯Y病毒外壳蛋白基因(PVY-cp)、TMV和PVY病毒复制酶基因和苏云金杆菌杀虫蛋白(BT)等基因，根据这些目的基因序列，设计引物用于阳性样品的目的基因鉴定。921 烟草普通花叶病外壳聋白基因TMV-epTMVl 5一GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC一3TMV2 5一CACCGTTGCGTCATCTACTCTACG一3其PCR扩增产物片段长度为32
19、7bp。922黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因CMV-cpCMVl 5一ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG一3CMV2 5一ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG一3其PCR扩增产物片段长度为264bp。923马铃薯Y病毒外壳蛋白基因PVY-cpPVYl 5一GATATTTCAAATACTCGGGCA一3PVY2 5一GCATAACGCGCTAAACCCAT一3其PCR扩增产物片段长度为362bp。924 TMV复制酶基因TMV54KDT54D1 5一GAGTTGTCTGGCATCATTGA一3T54D2 5一ACAATGGTCAAAGCCGGGTA一3其PCR扩增产物片段长度
20、为296bp。925 PVY复制酶基因PVY-nibPVY nibl 5一GCTCCGGTGTAAGGAGAAGA一3PVY nib2 5一GtGAGCCATCAGCATCACAG一3其PCR扩增产物片段长度为230bp，926苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt-cryIA(c)BTl 5一CAGTTTCTGCTCAGCGAGT一3BT2 5一GCTGAGGTGAAGATTAGCTG一3其PCR扩增产物片段长度为381bp。927黄瓜花叶病毒微卫星RNA CMVsat RNACMVsatl 5一CTGCGTGATGATCCTTCACT一3，CMVsat2 5一TTCACGGAGATCAGCATAGC一
21、3其PCR扩增产物片段长度为322bp。928豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTIcptil 5一TTGCTTGAACCACCTCGGAACT一3cpti2 5一CTTGCCTGGCATTGATCGTGTA一3其PCR扩增产物片段长度为196bp。929草甘膦耐药基因EPSP(5-烯醇丙酮酰一莽草酸-3-磷酸合成酶)EPSPl 5一tccagccatccgcgaacaag一3EPSP2 5一agcagcggcggaatcagcat一3其PCR扩增产物片段长度为265bp。上述各种引物(921929)PCR扩增体系和条件见附录D。93结果验证试验对于35S启动子和nos终止子序列引物的PCR扩增均未出
22、现阳性条带的样品，进行巢式或半巢式6GBT 243 1 02009PCR扩增，以提高检测的灵敏度，若仍没有扩增产物，可确定该样品为阴性，不含转基因烟草成分；对于35S启动子和(或)nO$终止子序列引物的PCR扩增同时或有一种出现阳性条带的样品，重新提取DNA，重复前述PCR检测排除污染，同时进行巢式PCR扩增和限制性内切酶酶切反应排除非特异性扩增的可能。931巢式或半巢式PCR反应验证将第一次扩增的产物(引物为35S-I和35S-2或NOS-1和NOS-2)2超纯水稀释i00倍，取1 pL作为第二次扩增的DNA模板，以下列引物进行第二次扩增，扩增体系与扩增条件见附录D。9311 35S巢式PC
23、R35S3 5GATTGTGCGTCATCCCTT一335S4 5ACAGTGGTCCCAAAGATGGA一3，扩增产物片段长度为127bp。9312 35S半巢式PCR35Ssnl 5一CTACAAATGCCATCATTGCG一335Ssn2 5一GATAGTTGGGATTGTGCGTCA一3扩增产物片段长度为192bp。9313 nos终止子巢式PCRNOSnl 5一GAATCCTGTTGCCGGTCTTG一3，NoSn2 5一CCCATCTCATAAATAACGTC一3，扩增片段长度为104bp。932限制性内切酶酶切反应验证应用该验证方法前提条件：PCR扩增过程中，将PCR扩增体系中的
24、dNTPs液中的“dUTP”替换成“dTTP”，浓度为25 mmolL。9321 PCR产物的纯化PCR扩增产物凝胶电泳后，紫外观察，并选择特异性条带用锋利刀片切下，应用凝胶中DNA回收试剂盒回收特异性PCR扩增条带(DNA)。9322酶切反应93221 35S启动子对于出现35S PCR扩增条带的回收样品，采用限制性内切酶EcoRV对扩增产物进行酶切分析，方法是先将PCR扩增产物纯化，加限制性内切酶EcoRV 5U，35S PCR扩增产物10 pL，限制酶2倍体积的酶切缓冲液配制酶切反应液，37恒温水浴中酶切3 h后，以酶切前后的DNA进行16琼脂糖电泳，紫外分析仪观察胶片上的条带，若为35
25、S特异PCR扩增产物，其205bp片段被酶切成152bp和53bp两个片段。93222 nos终止子对于nos引物PCR反应呈阳性的回收样品，利用限制性内切酶NsiI可将213bp的片段切成126bp和87bp的两条片段，反应条件同35S启动子扩增产物的酶切反应。933扩增产物的测序验证将PCR扩增条带切胶回收测序，排除非特异性扩增。94转基因检测控制凡出现PCR特异条带亮度(或荧光信号)等于或高于01参比对照的样品确定为阳性，有扩增条带，且亮度(或荧光信号)弱于01的样品要重新提取DNA，重复上述检测。10转基因烟草定量检测选择35S启动子或nos终止子进行荧光定量PCR检测(63)。7GB
26、T 243102009101 TaqMan探针荧光定量PCR检测法1011靶序列引物和TaqMan探针35S启动子靶序列引物：35SF：5一GTCTTGcGAAGGATAGTGGGA一335SR：5一CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA一3TaqMan探针：35STMP：5一TGCGTCATCCcTTAcGTcAGTGGAGAT一3nos终止予靶序列引物：nosF：5一AGGATTCAATCTTAAGAAA(-3nosR：5一GGATCTCATGCTGGAGTTCT一3TaqMan探针：iIOS TMP：5一ATGTTTGAACGATCGG一3上述靶序列TaqMan探针的荧光标记为5FA
27、M3TAMRA1012看家基因引物和TaqMan探针引物：NR F 5 7-TGTCATGAACAGATGGCTCTAACTCT一3NR R 5一TACCTTGATTACTCGTCGAGTGAAGA一3TaqMan探针：NRSTMP 5。ATTCCa_rTrrrAAlcAIvITGAAGGTACTCAlvIv兀”兀vrCG一3荧光标记为5TET&3TAMRA1013反应体系见附录F。1014反应条件见附录F。102 SYBR Green I荧光染料实时定量PCR检测法1021靶序列引物同1011中35S启动子、nos终止子和nos终止子与NPTII交界处靶序列引物。1022反应体系见附录F。1
28、023反应程序见附录F。103标准曲线的建立1031相对含量标准曲线的建立利用5种已知含量的标准物(含转基因烟草5、2、1、05和01)进行荧光定量PCR反应，建立转基因成分相对含量与PCR反应ct值(有看家基因同时扩增时应用看家基因与目标基因的ACt值)之间的标准曲线和回归方程。1032绝对含量标准曲线的建立通过标准物的碱基数和紫外分光光度计(62)ODm确定标准物的拷贝数，设置不同拷贝数的标准模板进行荧光定量PCR反应，建立靶序列拷贝数与ct值(或ACt值)之间的标准曲线。104样品阳性含量的分析各样品的阳性含量根据该样品的ct值(或ACt值)和标准样品所建立的标准曲线和回归方程进行计算。
29、1 1转基因烟草检测验证标准111 DNA提取物的浓度与纯度DNA提取物浓度100 ng*L；DNA提取物纯度：17OD260OD2801_9。8GBT 243102009112检测过程1121定性检测PCR反应中提取空白对照、阴性对照和PCR试剂对照无扩增条带，01含量的阳性出现明显的特异性条带。酶切验证试验中，阳性对照扩增产物的酶切反应完全，待测样品酶切产物长度正确。1122定量检测同时满足以下条件，扩增结果方可接受：提取空白对照、阴性对照和PCR试剂对照Ct40；回归方程的相关系数达到095以上；阴性样品ct值大于01样品的ct值；所有阳性标准参比ct值重复操作的CV(变异系数)15；待
30、测样品ct值重复操作的CV(变异系数)20。12检测报告检测报告应包含以下信息：送样单位与送样人；取样地点与样品产地；检测样品的种类与状态；生产年度；收样日期；检测标记及所用的验证反应；所提取样品DNA的浓度和纯度；几种对照的表现；烟草转基因检测结果报告单的样式参见附录G。检测报告应详细记录所测结果，也应该说明非本标准规定或被认为是可供选择的所有操作细节以及可能影响检测结果的任何细节。检测报告应包括确认样品所必需的所有资料。GBT 243102009附录A(规范性附录)含EB电泳液的处理方法A1 将溴化乙锭(EB)溶液用水稀释至浓度低于05 mgmL。A2加入一倍体积的05 molL KMnO
31、。溶液，混匀，再加入等量的25 molL HCI，混匀，置室温数小时。A3加入一倍体积的25 molL NaOH溶液，混匀并废弃。附录B(规范性附录)各类样品的DNA提取方法GBT 243102009B1种子B11取液氮研磨后的粉末约300 mg，加入300 pL 2CTAB提取缓冲液，充分混匀后在65中水浴10min。B12加入等体积的三氯甲烷异戊醇(24：1，体积分数)，混匀后在12 0009离心4 min。B13取上清液，加十分之一体积的10XCTAB提取缓冲液，加入等体积的三氯甲烷异戊醇(24：1，体积分数)，混匀后在12 0009离心4 min。B14取上清，加等体积CTAB沉淀缓冲
32、液，混匀后在150 009下离心8 min。B15去上清，沉淀加100 pL高盐TE，65水浴10 min。B16加入两倍体积的冷无水乙醇(-20冰箱贮存)，一40冷置30 min。B17 150 009离心8 min，沉淀溶于70 pL超纯水中。B2鲜烟叶DNA提取方法同第B1章。B3烤后烟叶(烟丝)B31 向内盛60 mg左右待测样品的15 mL离心管中，加入450 pL超纯水，250 pL 2CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后，65的恒温水浴10 min。B32加700 pL三氯甲烷异戊醇(24：1，体积分数)，混匀后在120 009离心5 rain。B33取上清液，加十分之一体积的10CT
33、AB提取缓冲液，加入等体积的三氯甲烷异戊醇(24：1，体积分数)，混匀后在120 009离心5 min。B34取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀后在150 009离心8 min。B35去上清，加100”L高盐TE缓冲液，65水浴10min。B36加入二倍体积冷无水乙醇，于一40冷置30 min。B37 150 009离心8 min，弃上清，沉淀溶于50 pL超纯水中。GBT 243102009附录C(规范性附录)DNA提取物的浓度和纯度的测定方法C1紫外区波长扫描C11 烟叶DNA提取物的产量和纯度用紫外分光光度计220 nm和320 nm之间的波长扫描来估测。C12用超纯水将紫外分光
34、光度计调零，校正基线。C13将10 PL DNA提取液加入比色皿中，加超纯水1 990 PL后，移液器抽打混匀，进行220 nm320 nm波长扫描。c14提取的DNA产量以260 nm下的吸光值来计算，OD值为1相当于每毫升溶液中含有50 pg双链DNA。C15 DNA提取物纯度用OD260280的值来估算，比值在1719为纯度较好，比值大于I9提取的DNA中含RNA，比值小于17提取液中含一些蛋白质等杂质，要重新提取DNA。c2硝酸还原酶基因序列PCR扩增提取DNA的质量可通过对其进行烟草内源硝酸还原酶基因序列扩增来判定，引物序列为：NR一1 5一GTGTCATGAACAGATGGCTC一
35、3NR一2 5一GATTACTCGTCGAGTGAAGA一3扩增片段长度为104bp。D1 PCR扩增体系附录D(规范性附录)烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件GBT 243102009按每50 pL反应含DNA聚合酶1 U，UNG酶1 U(巢式PCR中不加)，上行和下行引物各25 pmo，dNTPs 1 pL，10PCR bMfer 5 pL，根据所作扩增的管数，计算出各组分应加的总体积，配母液混匀后，再分装至各个025mL扩增管中，然后根据所测得的ODz”按600ng加入DNA模板。D2 PCR扩增条件采用下列循环程序进行扩增：热启动UNG酶：50，5 min(巢式PCR去除此步)预变
36、性：95下5 min循环设定：变性9430 s退火45 s(温度见表D1)延伸7245 s循环次数：35个循环后延伸：725 min各种PCR引物的退火温度见表D1。表D1各种PER引物的退火温度引物 退火温度 引物 退火温度NRl一NR2 61 CMqibl一CMVNib2 6235S135S2 64 BTl一BT2 63NOSl一NOS2 63 CMVsatlCMVsat2 64NPTl一NPT2 65 CMVmplCMVmp2 64TMVl一TMV2 64 CPTll一CPTl2 64CMVl CMV2 64 EPSP卜EPSP2 64PVYl一PVY2 63 35S335S4 62T5
37、4D1一T54D2 63 35SSnl一35SSn2 63PVYNiblPVYNib2 64 NOSnlNOSn2 62GBT 243102009附录E(规范性附录)溶液的配制E1 EDTA溶液(1 000 mL，05 molL，pH80)。准确称量1861 g乙二胺四乙酸钠溶于800 mL超纯水中，磁力搅拌，滴加12moiLNaOH调pH至80。定容至1 000mL。121灭菌15 rain，4冰箱中保存，每3个月重新配制。E2 Tris-HCI缓冲液(1 000 mL，pH80)准确称量121 g Tris碱溶于900 mL超纯水中。加浓盐酸(116molL)约46mL调pH值至80。超纯
38、水定容至1 000 mL。E3 TE缓冲液(100 mL，10 mmolL，pH80)100 mL TrisHCI缓冲液中加入200 pL EDTA溶液(o5 molL pH80)，4冰箱中保存。E4 2CTAB提取缓冲液(100 mL)称取2 g CTAB、8181 6 g NaCl，1 g PVP并加入60 mL超纯水磁力搅拌使其溶化。加入20 mL 05 molL Tris-HCl缓冲液(pH8o)。加入4 mL 05 molL EDTA(pH80)。定容100 mL，4冰箱中保存。E5 10xCTAB缓冲液(100 mL)称取10 g CTAB，4090 8 gNaCl。加入80 mL
39、超纯水，磁力搅拌使其溶解。定容100 mL，4冰箱中保存。E6 CrAB沉淀缓冲液(100 mL)称取1 g CTAB加人80 mL超纯水，磁力搅拌使其溶解。加入10 mL 05 molL Tris-HCl缓冲液(pH8o)。加入2 mL 05 molLEDTA(pH8o)。定容100 mL，4冰箱中保存。E7高盐TE缓冲液(100 mL)14称5844 g NaCl，加80 mL超纯水搅拌溶解。加2 mL 05 molL Tris-HCl缓冲液(pH8o)。加200 pL 05molLEDTA(pH8O)。定容100 mL，4冰箱中保存。E8三氯甲烷异戊醇(24：1，体积分数)量取96mL三
40、氯甲烷和4mL异戊醇加入100mL广口瓶中。摇匀后，分装在3个广口瓶中。4冰箱中保存。E9 50TAE称取Tris碱242 g、冰乙酸571 mL、05 molL EDTA(pH8o)20 mL。超纯水定容1 000 mL，4冰箱中保存。E10 5TBE的配制称取Tris碱54 g、硼酸275 g、05 molL EDTA(pH80)20 mL。超纯水定容1 000 mL，4冰箱中保存。稀释5倍为1TBE，稀释10倍为05TBE。E1 1 溴酚蓝上样缓冲液的配制称取蔗糖(400型)150 mg。加入1溴酚蓝150 pL，1二甲苯青FF 150 pL。超纯水定容1 000 pL，4冰箱中保存。E
41、12 15琼脂糖凝胶的制备GBT 24310一2009称15 g琼脂糖于100mL三角瓶中，加100mLlTAE电泳缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解。加5 pL溴乙锭，摇匀，待温度约45后倒人已经放好梳子的胶模中，琼脂糖完全凝结后拔出样梳。GBT 243102009F1 TaqMan探针附录F(规范性附录)荧光定量PCR扩增体系与扩增条件F11反应体系组分UNG酶10PCR buffer(含MgCl2325 retoolL)AmpliTaq Gold DNA聚合酶dNTPs引物1引物2荧光探针模板DNATotalF12反应条件热启动UNG酶：50，5 min预变性：95，5min循环设定：变性9
42、520 s退火6230 s读板循环次数：40个循环F2 SYBRGreen I荧光染料F21反应体系组分10PCR bufferDNA聚合酶dNTPsUNG酶引物1引物25SYBR Green I模板DNAdH20F22反应条件热启动UNG酶：50，5 min预变性：95下5 min循环设定：变性9430 s6体积(终浓度)05 U25“L25 U1 pL(dATP、dCTP、dGTP各25 mmolLdUTP 5 retoolL)200 nmolL200 nmolL200 nmolL100ng25“L体积25“L025“L(125 U)1 t1L(dATP、dCTP、dGTP各25 mmol
43、L，dUTP 5 retoolL)05 U025 t1L(5 pm01)025 ILL(5 pm01)025“L1“L(100 ng200 ng)19625“L退火6445 s延伸7245 s读板循环次数：35个循环GBT 24310200917GBT 243102009附录G(资料性附录)烟草转基因检测结果报告单烟草转基因检测结果报告单见表G1。表G1 烟草转基因检测结果报告单 No送样单位 送样人sample provider sampling person样品来源产地 样品类型sampleindex sample type样品等级品种 生产年度sample gradevariety cr
44、oP time样品品脾条码 样品其他信息sample brandbarcode other information收样时间 样品状态sample receive date检测方法 检测项目 转基因检测detection method detection item GMT detection提取样1 浓度(yield)：OD260- 纯度(purity)：OD260OD280=extract 1DNA评价DNA Check 提取样2 浓度(yield)：OD260一 纯度(purity)：OD260OD280=extract 2PCR检测 extract 1 35S_promoter： NOS-
45、terminator NPTII sequence：PCR detection extract 2 35S-promoter： NOS-terminator： NPTII sequence：对照表现 阳性对照： 阴性对照： 提取对照：controls performance positive control： negative control： blank：备注 P：PCR检测阳性； N：PCR检测阴性 其他说明note P：positive result； N：negative result结论批准人 审核人 编制人authorized18(检测单位盖章)检测时间： 年 月 日TESTDATE：
