1、ICS 7110070Y 42 a亘中华人民共和国国家标准GBT 24404-2009IS0 2 11 49：2006化妆品中需氧嗜 温性 细菌的检测和计数法Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria in cosmetics(ISO 21149：2006，Cosmetics-Microbiology-Enumeration anddetection of aerobic mesophilic bacteria，IDT)2009-09-30发布 2009-12-01实施宰瞀徽紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会捉仲刖 置
2、GBT 24404-2009IS0 21 149：2006本标准等同采用ISO 21149：2006化妆品微生物学需氧嗜温性细菌的检测和计数(英文版)。本标准等同翻译IsO 21149：2006。为便于使用，本标准做了下列编辑性修改：a)删除国际标准的前言。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。本标准由全国进出口食品安全检测标准化技术委员会(SACTC 445)归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国河南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、苗丽、赵宏、杨捷琳、
3、靳海彤。GBT 24404-2009IS0 21149：2006化妆品中需氧嗜温性细菌的检测和计数法1范围本标准规定了化妆品中需氧嗜温性细菌的常规检测和计数方法，可经需氧培养后对琼脂培养基上的茵落数计数，或检查经增菌后有无细菌生长。本标准可能不适用于某些难溶于水的产品和清洁类用品等样品的检验，可用被证实具有相同效果其他试验方法替代。必要时，可选用本标准的参考文献中列举的确证方法对检测和计数的微生物进行确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研
4、究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ISO 21148化妆品微生物学微生物检验通则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31需氧嗜温性细菌aerobic mesophilic bacteria在本标准规定的需氧条件下生长的嗜温性细菌。注：在该条件下，酵母菌、霉菌等其他类型的微生物也可能生长。32产品product实验室获得用于检测的化妆产品部分。33样品sample检测中用于制备初悬液的产品部分(至少i g或I mL)。34初悬液initial suspension一定体积的溶液(稀释剂、中和剂、肉汤或其混合物)制成的样品悬液或溶液。35样品稀释液
5、sample dilation用于制备初悬液的稀释液。4原则41一般性原则本方法涉及非选择性琼脂培养基上的菌落计数，或是增菌后有无细菌生长。样品中可能抑制细菌生长的物质应被中和，以便于检测存活的细菌。无论何种情况和使用何种方法，对产品抑菌性能的中和效果都应被检查和确认。1GBT 244042009lsO 21149：200642平板计数法平板计数法包括以下步骤：使用特定培养基，制备倾注平板或涂布平板，然后将一定量产品的初悬液或稀释液接种到平板中；将平板在有氧条件下325士25培养72 h6 h；计数菌落形成单位(CFU)，并计算每mL或每g产品中需氧嗜温性细菌的数量。43膜过滤法膜过滤法包括以
6、下步骤：按验证过的步骤(见1334)，将一定量制备好的样品悬液，通过事先由少量无菌稀释剂润湿的过滤装置进行过滤处理和清洗，然后将过滤膜移至特定琼脂培养基的表面(见ISO 21148)；在有氧条件下，置32525培养72 h士6 h；计数菌落形成单位(CFU)，并计算每毫升(mL)或每克(g)产品中需氧嗜温性细菌的数量。44经增菌处理后检测细菌增菌后细菌的检测包括以下步骤：将一定量初悬液加入到非选择性液体培养基(含有合适的中和剂和或溶剂)中，置325土25条件下，至少培养20 h；将一定量的上述增菌液接种到非选择性琼脂培养基上；在有氧条件下32525、培养48 h72 h；检查细菌生长情况，结果
7、表达为每份质量或体积的样品中需氧嗜温性细菌“阳性阴性”。5稀释剂、中和剂和培养基51原则通常的规格要求在ISO 21148中已有详细描述。配制用水为蒸馏水或纯净水在ISO 21148中也有详细规定。下列稀释剂、中和剂和培养基适用于需氧嗜温性细菌的检测，其他证实有效的稀释剂、中和剂和培养基也可用于本标准。52中和稀释剂和稀释剂521原则稀释剂用于分散样品，如果样品含有抑菌性物质，稀释剂中可添加中和剂。在检测前应该确认中和剂的效果(见第13章)；有关合适的中和剂信息在附录A有介绍。522中和稀释剂5221 酪蛋白消化物一大豆卵磷脂一吐温20培养基(SCDLP 20肉汤)52211成分胰酶消化的酪蛋
8、白 200 g大豆卵磷脂 50 g吐温20 400mL水 9600mL52212制备将吐温20溶于960mL水中，在49土2水浴中加热混匀；然后加入胰酶消化的酪蛋白和大豆卵磷脂，持续加热30 min溶解；混合均匀后分装至合适的容器中，置121高压灭菌15 rain后，在室温下调整pH值至73土02。5222其他中和稀释剂适当情况下也会用到其他中和剂，参见附录A和附录B。2GBT 244042009ISo 21149：2006523稀释剂5231液体A52311成分动物性蛋白胨 10 g水 1 000 mL52312制备将1 g蛋白胨溶于10 L水中，加热并持续搅拌溶解；混合均匀后分装至合适容器
9、中，置121高压灭菌15 rain。灭菌后，在室温下调整pH值为7102。5232其他稀释剂适当情况下也会用到其他稀释剂，参见附录c。53细菌悬液稀释剂(胰蛋白胨盐溶液)531成分胰蛋白胨 10 g氯化钠85 g水 1 000 mL532制备将上述成分溶解在水中，加热并持续搅拌，混合均匀后分装至合适容器中，置121高压灭菌15 rain后，在室温下调整pH值至7o土02。54培养基541原则培养基应按如下方法配制，或按照制造商所介绍的方法使用脱水培养基。当合成培养基的成分和(或)使用范围与这里给出的配方相同时也可使用。542计数用培养基5421大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(SCDA)或胰胨大豆琼
10、脂斜面(TSA)54211成分胰酶消化的酪蛋白 150 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5o g氯化钠 50 g琼脂 150 g水 1 000 mL54212制备将上述成分或完全脱水培养基溶解在水中，加热搅拌溶解；然后分装在合适的容器中；置121高压灭菌15 rain后，在室温下调整pH值至7302。5422其他计数用培养基适当情况下也会用到其他培养基，参见附录D。543检测用培养基5431原则在进行选择时，增菌肉汤和琼脂培养基可用于细菌检测。增菌肉汤用于分散样品并增加初始微生物的数量。若待测样品具有抑菌性时，在增菌肉汤中可添加中和剂。5432增菌肉汤：Engon LT 100肉汤54321原则这种
11、培养基包含具有中和样品中抑制性物质的成分(卵磷脂和吐温80)和分散剂(辛基酚聚醚9)。3GBT 244042009Iso 21 149：200654322成分胰酶消化的酪蛋白 150 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物 50 gL一胱氨酸07 g氯化钠40 g亚硫酸钠02 g葡萄糖 55 g卵磷脂 10 g吐温80 50 g辛基酚聚醚9 10 g水 1 000 mL54323制备将吐温80、辛基酚聚醚9和卵磷脂先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解；再边加热搅拌边加入其他成分进行溶解；然后将培养基分装在合适的容器中。置121高压灭菌15 min后，在室温下调整pH值至7002。5433检测用琼脂培养基543
12、31 Eugon LTl00琼脂培养基543311成分胰酶消化的酪蛋白 150 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物 50 gL一胱氨酸07 g氯化钠40 g亚硫酸钠02 g葡萄糖 55 g卵磷脂 10 g吐温80 50 g辛基酚聚醚9 10 g琼脂 150 g水 1 000 mL543312制备将吐温80、辛基酚聚醚9和卵磷脂先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解；再边加热搅拌边加入其他成分进行溶解，轻轻搅拌避免飞溅；然后将培养基分装在合适的容器中；置121高压灭菌15 min灭菌后，在室温下调整pH值至7O士02。54332其他检测用琼脂培养基其他可使用的培养基可参见附录D。544标准菌株培养用琼脂培养基
13、使用大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(SCDA)或胰胨大豆琼脂斜面(TSA)(5421)。6仪器设备及玻璃器皿仪器、设备和玻璃器皿见ISO 21148。47微生物菌种GBT 244042009Iso 21 149：2006为了验证中和剂的功效，分别使用了革兰氏阴性和阳性1”的两种标准菌株：铜绿假单胞菌ATCC 9027(等效菌株：CIP 82118、NCIMB 8626、NBRC 13275、KCTC 2513或其他等效的国家收藏标准菌株)；金黄色葡萄球菌ATCC”6538(等效菌株：CIP”483、NCIM9518、NBRC”13276、KCTC21916或其他等效的国家收藏标准菌株)。其他可供选
14、择的革兰氏阴性菌株有：大肠杆菌ATCC 8739(等效菌株：CIP 53126、NCIMB 8545、NBRC 39722、KCTC 2571或其他等效的国家收藏标准菌株)。应按照标准菌株供应商提供的操作方法复苏菌种。菌种应按EN 12353要求保存在实验室中。8化妆品产品和实验室样品的处理如果待测的化妆品在室温下保藏的话，在分析前后不需要对产品(32)和样品(33)进行孵育、冷藏和冷冻处理。待测化妆品的抽样见ISO 21148，样品的分析按照ISO 21148的要求和下列步骤进行。9步骤91一般建议使用无菌材料、仪器和无菌操作技术来制各样品、初悬液和稀释液。样品初悬液从完成制备到接种培养基内
15、的时间不能超过45 min，除非程序或文件中有特别注明。92初悬液的制备921原则在检测中，使用至少1 g或1 mL的混合均匀的产品来制备样品初悬液。注：S代表样品准确的质量或体积。初悬液通常是1：10的样品稀释液。如果存在重度污染和(或)1：10的稀释液仍存在抑菌性，就需要更大量的稀释液或增菌肉汤。922水溶性产品依照方法的要求，将化妆品样品(S)21入到适当体积的中和稀释剂(522)、稀释剂(523)或增菌肉汤(5432)中。注：稀释倍数为d。923非水溶性产品将化妆品样品(s)2n入到装有适量促溶剂(例：吐温80)的合适容器中。将样品分散在促溶剂中，按照方法的要求，加入适量(例：9 mL
16、)的中和稀释剂(522)、稀释剂(523)或增菌肉汤(5432)中。注：稀释倍数为d。93计数方法931稀释计数通常，初悬液是最初始的计数稀释度。依照产品污染的预期程度，如果必要的话，可使用相同的稀释剂将初悬液进行连续稀释，制成系列梯度的稀释液(例：1：10稀释度)。1)CIP：法国巴斯德研究所菌种保藏中心。2)KCTC：韩国典型菌种保藏中心。3)ATCC：美国标准生物品收藏中心。4)NCIMB：英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心。5)NBRC：日本技术评价研究所生物资源中心。GBT 24404-2009IS0 21 149：2006一般计数方法至少需要两个培养皿。但在常规检测中或同一种样品的
17、梯度稀释中或参考以前的结果时，可以只使用一只培养皿。932平板计数法9321倾注平板法在直径为85 mm100 rnm的培养皿中，加入1 mL初悬液和样品稀释液(见第13章)，倒人15 mL20 mL琼脂培养基(542)(保存在不超过48的水浴中)。如果使用更大的培养皿，倒人的琼脂培养基的量应相应增加。小心旋转或倾注平板以使初悬液和(或)样品稀释液与培养基充分混合。在室温下，将培养皿放置于水平面上使平皿中的混合物凝固。9322涂布平板法在直径为85 mm100 mm的培养皿中，加入15 mL20 mL混合好的琼脂培养基(542)(保存在不超过48的水浴中)。如果使用较大的培养皿，琼脂培养基的量
18、应相应增加。将培养皿放入微生物箱或培养箱中使其冷却凝固。然后，将不少于01 mL的初悬液和(或)确认制备好的样品稀释液(见第13章)，涂布在培养基的表面。9323膜过滤法使用表面孔径小于045 pm的滤膜。将适量的初悬液和样品稀释液(见第13章)(不少于1 g或1 mL的产品为宜)加到滤膜上，立即过滤和洗膜(按照确认的步骤进行，见第13章)。将滤膜转移至琼脂培养基的表面(542)。9324培养除非有其他规定，通常倒置平板放入325土25的培养箱中，培养72 h6 h后，立即计数平板上的菌落数，如果不能立即计数，可将平板保存在冰箱内，但保存时间不得超过24 h。注：在某些情况中，产品内存在影响菌
19、落计数的潜在物质时，则可以使用保存于冰箱中的具有相同样品稀释度和琼脂培养基的平行平板与培养过的平板进行比较。94增菌941原则使用增菌肉汤(5432)制备初悬液(见92)时，选择下列步骤进行确认(见第13章)。942样品培养9421原则用肉汤(5432)制备的初悬液，置325土25下培养至少20 h。9422次培养使用灭菌移液管，将01 mLo5 mL培养后的初悬液移至装有大约15 mL20 mL的适合的选择性培养基(5421)的表面(培养皿直径85 mm100 mm)。如果使用较大的培养皿，琼脂培养基的量应相应增加。9423培养翻转培养平板(或者等到加入的悬液被琼脂吸收后再翻转)，置3252
20、5下培养48 h72 h。10菌落计数(平板计数和膜过滤法)培养后，计算菌落数：培养皿中应有30 CFU300 CFU，如果低于30 CFU，见1223。在滤膜上应有15 CFU150 CFU，如果低于15 CFU，见1223。11 生长的检测(增菌法)增菌液移至琼脂培养板进行培养后，检查琼脂表面，记录有无细菌生长。612结果表示121 平板菌落计数的计算方法计算样品(s)中的细菌数量N，按式(1)、式(2)、式(3)计算Nm(Vd)Nc(yd)NX，(yd)式中：m平行样菌落计数的算术平均数；y每个平皿中接种物的体积，单位为毫升(mL)；d在合适计数范围内的最低稀释度的稀释倍数；c单个平板上
21、的菌落数；墨两个连续稀释度的菌落计数的加权平均数。x。按式(4)计算：X一c(n1+0Inz)式中：c两个连续稀释度的所有平板的总菌落数；n。在合适计数范围内的最低稀释度的平板数；GBT 24404-2009IS0 21149：2006(1)(2)(3)nz在合适计数范围内的第二个稀释度的平板数。计算结果保留两位有效数字。如果最后一位数字小于5，则前一位数字无须更改，如果最后一位数字大于5，则前一位数字加一位。逐步进行，直至得到两位有效数字，注意得到的数字N。122说明1221应充分考虑平板计数法固有的变异性。当两个结果之间的差异超过50，或者用log表示超过03，即认为这两个结果存在差异。为
22、了计数的精确性，只计数平皿上菌落数在30300之间或滤膜上菌落在15150之间的培养皿。按照所采用的方法检查不同稀释倍数下的菌落数(见第13章)。1222 当平板上菌落数在30300之间或膜上菌落数在15150之间，结果表示如下这里S表示样品(92)的质量或体积：若s至少为1 g或1 mL，且y至少为1 mL，那么每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量；NS；若s少于1 g或1 mL，且或y低于1 mL，那么样品中需氧嗜温性细菌(注意用于检测的样品的量应计算在s和y之内)的数量一N。将结果表示为10至99之间的数字乘以10的幂指数(见1231、1232、1233和1237)。1223当平板上菌
23、落数低于30或者膜上菌落数低于15，结果表示如下：若s至少为1 g或1 mL，且V至少为1 mL，那么每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量一NS；若s少于1 g或1 mL，且或V低于1 mL，那么样品中需氧嗜温性细菌(注意用于检测的样品的量应计算在s和y之内)的估算数量一N。S表示样品的质量或体积(92)。将结果表示为10至99之间的数字乘以10的幂指数(见1234、1235和1236)。1224当没有观察到有菌落生长时，结果表示如下：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量低于1dXVXS(S至少为1 g或1 mL)；样品S中需氧嗜温性细菌的数量低于1dXV(注意用于检测的样品的量应计算
24、在S和y之内)(S少于1 g或1 mL)。7GBT 24404-2009IS0 21149：2006d为初悬液(92)的稀释倍数且V为1(平板技术法和膜过滤法)或01(涂布平板法)(见1238)。123举例1231例1一个稀释度两个平板sl g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10、38和42。根据式(1)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量Nm(yd)一40(110-1)一4001400或4102。1232例2一个稀释度一个平板s一1 g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10、60。根据式(2)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量Nc(Vd)一60(110_1)一600160
25、0或6102。1233例3两个稀释度两个平板sl g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10根据式(3)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量N10 2587002226 682。2、235和282；稀释度为10、3l和39。X(VXd)一(235+282+31+39)(2+012)X将上述结果进行数字修约，结果为每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量是27 000或27104。1234例4一个稀释度两个过滤膜si g或I mL；V=1；计数可得：稀释度为10、18和22。根据式(1)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量Nm(Vd)一20(110。)一2001200或2102。1235
26、例5一个稀释度一个过滤膜Si g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10、65。根据式(2)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量Nc(Vd)一66(110“)一6501650或65X102。1236例6两个稀释度两个过滤膜s一1 g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10根据式(3)：每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量N1012660221 209。1、121和105；稀释度为10、15和25。瓦(VXd)一(121+105+15+25)(2+o1X 2)X将上述结果约整为每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量是l 200或12103。1237例7一个稀释度两个平板S一1 g或l
27、mL；V=1；计数可得：稀释度为10、28和22。根据式(1)：N=m(yd)一25(110-1)一2501250。每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量为250或25102。1238例8S一1 g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10、0和0。8GBT 24404-2009IS0 21149：2006根据式(1)：N1(vXd)1(110-1)1o110。每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量低于10。1239例9s一1 g或1 mL；V=1；计数可得：稀释度为10_。、0和3。根据式(1)：Nm(yXd)1s(1i0_1)150115。每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量
28、低于15。124增菌后检测具有生长的情况下(见第11章)，结果表示为“样品S中存在需氧嗜温性细菌”，然后使用其中一种推荐方法(见93)进行计数。如果没有检测到生长(见第11章)，结果表示为“样品S中不存在需氧嗜温性细菌”。13产品的抑菌性的中和处理131原则以下不同试验说明微生物可以在分析条件下生长。常用于证明化妆品抑菌性的两种菌株(见第7章)被确认对抑菌物质具有较广泛的敏感性。132接种物的制备在试验前，每种菌株都应先接种在大豆酪蛋白琼脂培养基(SCDA)或其他合适(非选择性、非中和性)培养基上，置32525培养18 h24 h。为了收集细菌培养物，使用灭菌接种环，刮取培养基表面细菌重新悬浮
29、于稀释液中，以获得细菌悬浮液(53)，使用分光光度计调整细菌浓度约为1108 CFUmL，此细菌悬液及其稀释液需在2 h内使用。133计数方法的验证1331原则将样品液(初悬液或者因为产品的抑菌性过强或溶解性过低制成的样品稀释液)与每个细菌菌株的稀释液混匀、中和后，将中和液移至培养皿或过滤膜上，经培养后，与不含有样品的对照组进行菌落特性和菌落数的比较。如果菌落数在不足对照组的50(o3 log)以下，则需要调整内容(稀释剂、中和剂或混合肉汤，参见附录A)。应充分考虑平板计数法固有的变异性。当两个结果之间的差异超过50，或者用log表示超过03，即认为这两个结果存在差异。接种的标准菌不生长说明该
30、检测方法无效，除非认为产品的微生物污染是不同的。1332倾注平板法的验证将9 mL初悬液和(或)用中和稀释剂稀释的样品稀释液与1 mL含有1 000 CFUmL3 000 CFUmL的微生物菌悬液混合。移取1 mL至培养皿(最好有平行样)中，倒人15 mL20 mL混匀的琼脂培养基(542)(保存在不超过48的水浴中)。平行设立一个使用相同稀释剂和相同微生物9GBT 24404-2009150 21149：2006菌悬液，但不含有样品的对照平板。置325士25培养24 h72 h后，计数平板上菌落数，并比较检测平板与对照平板的菌落数。如果计数结果至少是对照平板的50(o3 log)以上，可以确
31、认1；10稀释(使用1 mL初悬液)时的稀释液和计数方法是有效的。1333涂布平板法的验证将9 mL用中和稀释剂(或其他，见51)稀释的初悬液与1 mL含有10 000 CFUmL30 000 CFUmL(使用05mL或1mL涂布时可更少)的微生物菌悬液混合，取至少1mL涂布在凝固的琼脂培养基表面(52)(最好有平行样)。平行制备一个使用相同稀释剂和相同微生物菌悬液但不含有样品的对照平板。置325士25培养24 h72 h后，计数平板上菌落数，并与对照平板上的菌落数进行比较。如果计数结果至少是对照组的50(03 log)以上，可以确认1：10稀释(使用1 mL初悬液)时的稀释液和计数方法是有效
32、的。1334膜过滤法的验证将适量初悬液或检测中使用的样品稀释液(见9323)与适量的大约100 CFU的微生物标准悬浮液混合。混合液立即膜过滤，并且使用一定量的水(51)、稀释剂(523)或中和稀释剂(522)洗涤滤膜，将滤膜转移至合适的琼脂培养基(542)的表面。平行地制备一个相同条件下不含有样品的对照样品，在相同条件下过滤和清洗。置325土25下，培养24 h72 h后，计数膜上菌落数，并与对照样品的菌落数进行比较。如果计数结果至少是对照组的50(o3 log)，可以确认膜过滤方法和稀释剂是有效的。134增菌检测方法的验证1341步骤制备含有每种标准菌株悬液、最终浓度为100 CFUmL5
33、00 CFUmL的9 mL细菌悬液稀释液(53)；为了计数标准菌悬液中最终活的细菌浓度，移取1 mL菌悬液至培养皿中，倾注15 mL20 mL琼脂培养基(542)(保存在不超过48的水浴中)。置325士25条件下，培养20 h24 h。在试管或烧瓶内加入一定量的增菌肉汤(5432)，制备与检测时相同条件的样品初悬液双份(至少1 g或1 mL产品)，在一个(确认试验)的试管内，无菌接种人01 mL标准菌悬液。混匀后，确认试验试管与对照试管均置于32525条件下，培养20 h24 h。使用无菌移液管从每个试管或烧瓶中，移取01 mL05 mL(与检测条件相同)至含有大约15 mL20 mL琼脂培养
34、基培养皿(直径85 mm100 ram)中。置32525条件下，培养24 h72 h。1342结果的说明对每个细菌菌株，检查并确认其悬浮液含i00 CFUmL500 CFumL的细菌。如果有细菌生长的特征，中和检测方法的验证定义如下：对金黄色葡萄球菌：培养物颜色为黄色；对铜绿假单胞菌：在确认平板上接种物的颜色为绿色到黄色茵落，在对照平板上不生长。当在对照平板上有细菌生长(污染产品)时，如果接种的细菌在确认平板上可以恢复生长，可以认为中和检测方法验证是有效的。135验证结果的解释验证平板上细菌不生长，表明抗菌活性依然存在，并且有必要对方法的条件进行修改。可通过增加营养肉汤的量、保持相同的样品数量
35、或者在营养肉汤中添加足量的失活剂，或者结合适当的修改来进行完善，以保证细菌生长。尽管添加适当的失活剂和增加肉汤量，上述可培养微生物还是有可能不能复壮，这表明本标准材料提供的信息可能不适合这类微生物。14检测报告检测报告应列出以下内容：1)产品完整鉴定所需要的全部信息10GBT 24404-2009S0 21 149：20062)使用方法；3)结果；4) 制备初悬液的所有详细操作步骤；5)方法中中和剂和培养基使用的描述；6)方法的验证，即使分开进行的测试；7)本文件中没有指出的或被认为非强制的部分，以及影响结果的任何细节。GBT 24404-2009IS0 21149：2006附录A(资料性附录
36、)针对防腐剂抑菌活性的中和剂和漂洗剂表A1 针对防腐剂抑菌活性的中和剂和漂洗剂防腐剂 中和剂 中和剂及漂洗液配方(膜过滤法)酚类化合物 卵磷脂，吐温80， 吐温80，30 gL+卵磷脂，3 gL。对羟基苯甲酸酯， 脂肪酸环氧乙烷聚 脂肪酸环氧乙烷聚合物，7 gL+卵磷脂，20 gL+吐温80，4 gL。苯基乙醇， 合物，非离子型表 DE中和培养基苯胺 面活性剂 漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，1 gL+氯化钠，9 gL；吐温80，5 gL。卵磷脂，皂角苷， 吐温80，30 gL+十二烷基硫酸钠，4 gL+卵磷脂，3 gL。季胺类化合物， 吐温80，十二烷基 吐温80，30 gL+皂角苷，30 gL+卵
37、磷脂，3 gL。阳离子表面活性剂 硫酸钠，脂肪酸环 DE中和培养基氧乙烷聚合物 漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，1 gL+氯化钠，9 gL；吐温80，5 gL。卵磷脂，3 gL+吐温80，30 gL+L一组氨酸，1 gL。甲醛 吐温80，30 gL+皂角苷，30 gL+L一组氨酸，1 gL+L一半胱氨酸，1 gL。乙醛甘氨酸，组氨酸DE中和培养基。漂洗液：吐温80，3 gL+L一组氨酸，05 gL。硫代硫酸钠，5 gL。氧化物 硫代硫酸钠漂洗液：硫代硫酸钠，3 gL。卵磷脂，皂角苷，异噻唑啉酮，眯唑 胺，硫醇，亚硫酸氢吐温80，30 gL+皂角苷，30 gL+卵磷脂，3 gL。漂洗液：蛋白胨，1 gL
38、+氧化钠，9 gL；吐温80，5 gL。钠，巯基乙醇卵磷脂，皂角苷， 吐温80，30 gL+皂角苷，30 gL+卵磷脂，3 gL。双胍吐温80 漂洗液：蛋白胨，1 gL+氧化钠，9 gL；吐温80，5 gL。金属盐类(Cu，Zn，重硫酸钠， 巯基乙醇，05 gL或5 gL。L-巯基半胱氨酸 L-半胱氨酸，08 gL或15 gL。I-Ig)，有机汞类 DE中和培养基巯基乙醇漂洗液：巯基乙醇，05 gL。8DE中和冉汤(DeyEngley中和肉汤)，参见附录D。12附录B(资料性附录)其他中和稀释剂GBT 24404-2009Is0 21149：2006B1原则如果其他的中和稀释剂经过检查和验证也
39、可用于制备样品初悬液，以下所列较适合应用的中和稀释剂配方。有关中和剂的材料可参见附录A。B2 Eugon LT 100液体肉汤见5432。B3酪蛋白胨卵磷脂聚山梨醇脂肉汤B31成分酪蛋白胨 10 g卵磷脂07 g吐温80 200 g水 980 mLB32制备经加热、搅拌和溶解上述成分，冷却至25装入合适的容器中，置121高压灭菌15 min；灭菌后，在室温下调整pH值至72士02。B4改良Letheen肉汤B41成分蛋白胨(肉酶消化产物) 200 g酪蛋白胰酶消化物 50 g牛肉膏 50 g酵母膏 20 g卵磷脂07 g吐温80 50 g氯化钠 50 g亚硫酸氢钠01 g水 1 000 mLB
40、42制备将吐温80和卵磷脂先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解。经加热、搅拌加入其他成分进行溶解。然后将培养基分装在合适的容器中，置121高压灭菌15min后，在室温下调整pH值至7202。GBT 24404-2009IS0 21 149；2006附录C(资料性附录)其他稀释剂C1原则如果其他的稀释剂经过检查和验证也可用于制备样品初悬液，以下所列较适合应用的稀释剂配方。C2缓冲蛋白胨水(pH 7)c21成分牛肉胨 l_0 g氯化钠43 g磷酸二氢钾 36 g磷酸氢二钠二水化合物 72 g水 1 000 mLC22制备将上述成分溶解在沸腾的水中。混匀，冷却至25装入合适容器中，置121高压灭菌15
41、 rain后，在室温下调整pH值至7102。附录D(资料性附录)其他培养基GBT 24404-2009IS0 21149：2006D1原则如果其他的稀释剂经过检查和验证也可用于制备样品初悬液。以下所列较适合应用的其他培养基。D2计数用琼脂培养基D21 Eugon LT 100琼脂培养基见54331。D22 LT 100琼脂D221成分胰酶消化的酪蛋白 150 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物 50 g氯化钠 50 g卵磷脂 10 g吐温80 50 g辛基酚聚醚9 10 g琼脂 150 g水 1 000 mLD222制备将吐温80、辛基酚聚醚9和卵磷脂先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解；经加热、轻轻搅拌
42、加入其他成分进行溶解，然后将培养基分装在合适的容器中。置121高压灭菌15 rain后，在室温下调整pH值至7002。D23添加大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(添加SCD肉汤琼脂)D231成分酪蛋白胨 170 g大豆蛋白胨 30 g氯化钠 50 g磷酸氢二钾 25 g葡萄糖 25 g琼脂 150 g水 1 000 mLD232制备将所有成分或干粉培养基先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解。然后将培养基分装在合适的容器中，置121高压灭菌15 min后，在室温下调整pH值至72：1：02。D3增菌肉汤D31改良Letheen肉汤目见第B4章。】5GBT 24404-2009IS0 21149：2006
43、D32大豆酪蛋白消化物卵磷脂吐温80培养基(SCDLP 60肉汤)D321成分酪蛋白胨 170 g大豆蛋白胨 30 g氯化钠 50 g磷酸氢二钾 25 g葡萄糖 25 g卵磷脂 10 g吐温80 70 g水 1 000 mLD322制备将所有成分或干粉培养基先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解。然后将培养基分装在合适的容器中，置121高压灭菌15rain后，在室温下调整pH值至724-02。D33 DE中和肉汤(DeyEngley中和肉汤)D331成分葡萄糖 100 g大豆卵磷脂 70 gNa2 S2035HzO 60 g吐温80 50 g酪蛋白胨胰酶消化物 50 gNaHS03 25 g酵母膏
44、 25 g巯基乙酸钠 10 g溴甲酚紫002 g水 1 000 mLD332制备将所有成分或干粉培养基先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解。然后将培养基分装在合适的容器中，置121高压灭菌15 rain后，在室温下调整pH值至764-02。D4检测用大豆酪蛋白消化物卵磷脂吐温80琼脂培养基(SCDLPA)D41成分酪蛋白胨 150 g大豆蛋白胨 50 g氯化钠 50 g卵磷脂 10 g吐温80 70 g琼脂 150 g水 1 000 mLD42制备经加热、搅拌溶解上述成分，分装到合适容器中，置121高压灭菌15 rain后冷却，在室温下调整pH值至7o02。GBT 24404-2009150 2
45、”49：2006参考文献1Microbiology Guidelines2001 published by the Cosmetic，Toiletry and Fragrance AssociationE23 Microbiological Examination of non-sterile products4th edition2002 published by the European Pharmacopoeia33 JP 14General tests-Microbial limit test2001 published by the Japanese Pharmacopoeia43
46、USP 28Microbial limit test 612005 published by the USPharmacopoeia5Bacteriological Analytical Manual8th edition1995 published by the USFood and DrugAdministration6SINGER，SThe use of preservative neutralizers in diluents and plating mediaCosmeticsand Toiletries102December 1987P557EN 10406 Chemical disinfectants and antiseptics Basic bactericidal activity Test method and requirements(phase 1)8ISO 1841
