1、ICS 11.020 C 05 道B中华人民共和国国家标准G/T 28940-2012 病媒生物感染病原体采样规程鼠类Sampling procedure of vector infected by pathogens-Rodent 2012-11-20发布俨问中华人民共和国卫生部峪舍中国国家标准化管理委员会Q(.IJ 2013-05-01实施民前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。GB/T 28940-2012 本标准主要起草单位:北京出入境检验检疫局、中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国疾病预防控制中心传染病预防控治
2、所。本标准主要起草人:郭天宇、刘艳华、任彤、董言德、鲁亮、夏连续。I GB/T 28940-2012 病媒生物感染病原体采样规程鼠类1 范围本标准规定了鼠及鼠血样和脏器取样方法、样本的保存方法以及整个过程的安全防护。本标准适用于感染或可能感染病原体的鼠类现场采样和保存。气2 规范性引用文件、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3 试剂及材料3. 1 消毒剂2%腆町、75%酒精。3.2
3、抗凝剂乙二股四乙酸(EDTA)、草酸盐合剂、肝素、拘橡酸铀、氟化铀、草酸何。制备及用量参见附录A。3.3 组织、脏器保存液20%中性甘油盐水、50%甘油磷酸盐缓冲液、组织保存液、RNAlater保存液。制备及用量参见附录B。3.4 麻醉荆乙醋、氯仿。3.5 其他液氮、干冰。4 实验用晶4. 1 实验用仪器设备生物安全柜、800C低温冰箱、高压灭菌器、液氮罐、离心机、移液器、带盖搪瓷盘、3号5号一次性针头注射器、直头眼科慑、眼科剪刀、大号慑子、吸管、平皿、冻存管、针线、鼠袋、鼠固定板、鼠固定盒、焚尸炉。GB/T 28940-2012 4.2 个人防护用具白(浅色防护服(连体服)、白色长筒袜、长筒
4、雨靴、元粉手套、口罩、眼罩、杀虫气雾剂。5 鼠样本采集5. 1 采集要求捕获鼠单体装鼠袋。登记捕获方法、时间、地点、状态(活体、死亡、是否腐败等)、鼠样本基本信息(重量、性别、体长、尾长、右后足长、耳高等采血和脏器组织样本前，用麻醉剂麻醉鼠和鼠体寄生虫，梳检寄生虫后，再进行血液和脏器，组织的采集。5.2 鼠样本采集方法/ 5.2. 1 鼠笼法5.3.1 左前肢腋窝下采血将鼠仰卧固定于鼠固定板上，消毒后将左胸皮肤剪开，并将皮肤与肌肉剥离，向左前肢展开而成一袋状，以消毒剪刀将左前肢腋下静脉剪开，用吸管或注射器吸取流出的血液。5.3.2 尾静脉采血将鼠装入固定盒内，盖上盒盖，露出鼠尾，用手揉擦或用温
5、水(45.C50 .C)加温鼠尾，也可用二甲苯等化学药物涂擦鼠尾，使鼠尾静脉充分充血后，用剪刀剪去尾尖，尾静脉血即可流出。用手轻轻从尾根部向尾尖部挤几下，可以采到数滴血。5.3.3 心脏采血将鼠仰卧固定于鼠固定板上，剪去心区部位的被毛，用腆町、酒精消毒皮肤。在左侧底3肋4肋2 电例. GB/T 28940-2012 间，用左手食指摸到心搏，右手取连有3号5号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺。当针头正确刺到心脏时，鼠血由于心搏自然进入注射器，即可进行取血。5.3.4 眼眶动脉和静脉采血用左手抓住鼠，拇指和食指尽量将鼠头皮肤捏紧，使鼠眼球突出。右手取直头眼科摄，在鼠右侧眼球根部将眼球摘去，并将鼠倒
6、置，头朝下，此时眼眶内很快流血，将血滴入预先加有抗凝剂的平皿内，直到元血液流出为止。5.3.5 后眼眶静脉丛连续穿剌采血脉，把此静脉剪5.4.5 另换灭菌剪刀，切开脑肌，剪断胸骨两侧软肋骨(呈倒V型)，翻起胸骨，再切取心脏和肺脏放入冻存管，保存在低温冰箱中或加保存液保存。5.4.6 取脑组织时，固定头部，用腆町消毒，剪开头皮露出头骨。再以腆町消毒，更换一套元菌剪、镖，沿脑部边缘剪开头骨用剪使脑与骨剥离，取出整个鼠脑放入冻存管，保存在低温冰箱中或加保存液保存。5.4.7 t刊解完毕，高压后按实验室垃圾处理，或将鼠尸投入焚尸炉焚化，或在75%酒精中消毒后深埋。用75%酒精处理生物安全柜台面，紫外消
7、毒30mino所用的器械都要高压消毒。3 GB/T 28940-2012 6 样本保存6. 1 鼠样本的保存6. 1. 1 活鼠将捕获的活鼠连同鼠笼(夹)装入鼠袋，扎紧袋口，严防跳蚤逃逸。6. 1. 2 死鼠将捕获的死鼠从鼠夹上取下，单只装入鼠袋，扎紧袋口，严防跳蚤逃逸。6.2 用于病原体检测鼠脏器样本的保存6.2. 1 冷冻保存用于细菌、病毒分离和检测的样本可直接冷冻保存(-80.C冰箱)，也可用化学制冷剂(如干冰)或在液氮罐中保存。6.2.2 保存遭保存含鼠疫耶尔森菌的组织或脏器的样本可用20%中性甘油盐水保存。用于病毒检测的组织样本可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中，在5.C条件下保存数周;
8、也可用组织保存液保存;或保存于RNAlater保存液(用于核酸检测的样本方可用这种方法，无法再进行病原分离检测)，样品储存液中保存的新鲜样品37.C下稳定保存1d, 18 .C25 c保存7d,2 C8 .C稳定4周，一20.C永久保存。6.3 血渣样本保存根据不同检测目的选取冷藏保存或加相应的抗凝剂保存，详见资料性附录A。7 安全防护要求7.1 现场采集的防护要求7. 1. 1 工作人员应穿白(浅)色防护服(连体服)、防蚤袜。放(收)夹时戴白色线手套，2人1组，可以相互检查身体是否有蚤或蝉，发现后及时清除。身体暴露部位也可使用驱避剂防护。7. 1.2 收夹时，不要用手直接接触鼠。装鼠袋时，动
9、作要快，随即扎紧袋口。对死(自毙)鼠或捕获口鼻出血的鼠，需用大号慑子，装入鼠袋后，外套1个塑料袋。鼠笼捕获的鼠，需连同鼠笼一起装入大号鼠袋。7.2 实验室安全防护要求7.2. 1 在鼠传疾病疫区采集鼠类样本时，工作人员应经过严格生物安全防护培训，合格后方可进行工作。7.2.2 鼠类样本采集、解剖时工作人员应做好个人防护，防止被病原体感染或鼠体外寄生虫叮咬。采血及解剖过程应按相应病原体生物安全级别在相应的实验室中进行，做好相应防护。7.2.3 开展病原体检测的实验室属专用实验室，其结构、防护水平、工作制度、工作人员着装(个人防护)、实验操作规程以及污物处理和意外事故的处理都符合相应的规定，详细参
10、照GB19489、WS233。7.3 预防接种工作人员应提前接种相关疫苗。4 . , 俨 GB/T 28940-2012 附录A(资料性附录)常用抗凝剂的制备及用量A.1 乙二肢四Z酸(EDTA)EDTA的铀盐或梆盐常在实验中作为抗凝剂，每毫升血样加1.5 mg2. 2 mg。加EDTA抗凝剂的新鲜冰冻血浆在一20.C以下可保存1a。A.2 草酸盐合荆草酸镀1.2g、草酸饵0.8g、福尔马林1.0 mL、蒸锚水加至100mL。每毫升血样加0.1mL. A.3 肝素20 U肝素可抗凝1mL血液。1%肝素溶液0.1mL于试管内，旋转试管，使溶液均匀浸湿试管内壁，放入80.C100 .C烘箱烤干，每
11、管能使5mL10 mL血液不凝。急性血压实验时可在充满生理盐水的动脉套管内注人肝素20mg25 mg。体内抗凝:500U/kgl 000 U/kg. A.4 拘椿酸铀配成3%5%水溶液，每毫升血样加0.1mL;也可直接加粉剂，每毫升血样加3mg5 mg。A.5 氟化纳每毫升血样加6mg氟化锅。A.6 草酸饵每毫升血样加1mg2 mg草酸御。或配置成10%水溶液，每毫升血样加O.01 mLO. 02 mL。在试管内加饱和草酸饵溶液2滴(或10%榕液0.2mL)，轻轻敲击试管，使溶液分散到管壁四周，置80.C以下的烘箱中烤干(烘烤温度过高，可使草酸饵分解为碳酸何而失效)，每管能使3mL5 mL 血
12、液不凝。供伺、钙含量测定的血样不能用草酸饵抗凝。5 GB/T 28940-2012 附录B(资料性附录)常用组织、脏器保存液的制备及用量B. 1 20%中性甘油盐水中性甘油(化学纯)20mL、氯化铀0.85g、蒸馆水80mL混匀后分装，高压灭菌。B.2 50%甘油磷酸盐缓冲液取等体积的甘油与等体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)混合，调节pH即可。100 mL O. 2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)具体配方为:0.2mol/L Na2 HP04 81 mL和0.3mol/ L NaH2P04 19 mL混合。B.3 组织保存液0.5%水解乳蛋白、2%小牛血清、青霉素500U
13、/mL、链霉素50U/mL、制霉菌素50U/mL组成的溶液。B. 4 RNAlater保存液10L/1 mg组织，采样后立即将新鲜样品浸入此试剂，RNAlater可以迅速渗透到组织中，保护RNA完整不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。6 、，、. 曹2r 时N-ON|。叮NH阁。，、哥 . 鼠类国华人民共和国家标准病媒生物感染病原体采样规程GB/T 28940-2012 中、 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(1000l3)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张O.75 字数13千字2013年4月第一次印刷开本880X12301/16 2013年4月第一版* 书号:155066. 1-46303定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28940-2012 打印日期:2013年4月24日F002
