1、, 、ICS 65.020.01 B 16 中华人民-tI: -、道B和国国家标准GB/T 28975-2012 离宦花叶病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法Detection and identification of leUuce mosaic virus-Nanoparticles-enlarged in colloidal gold immunochromatographic assay 2012-12-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2013-06-01实施发布GB/T 28975-2012 目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出
2、的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本标准主要起草人:李锦丰、陈艳、马吉湘、田世民、戴华、张帆、金涌、邹明强。I G/T 28975-2012 引本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围元任何立场。该专利持有人己向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且元歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以
3、下联系方式获得:该专利持有人:中国检验检疫科学研究院联系人:邹明强地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编:100123请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。E 1 范围离宦花叶病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法GB/T 28975-2012 本标准规定了用纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法检测高宦花叶病毒的原理、实验步骤及结果判定等。本标准适用于植物及其产品组织中离宦花叶病毒的快速筛查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用
4、文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 23629-2009 引进植物病原生物安全控制技术要求GB/T 23632-2009 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程3 离宦花叶病毒基本信息中文名:离宦花叶病毒学名:lettuce mosaic virus 缩写:LMV分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。离宦花叶病毒的其他信息参见附录A。4 方法原理基于肢体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规肢体金免疫层析试纸条进行处理，提高检测灵敏度，根据试纸条
5、颜色的变化，判定待测样品中是否存在离宦花叶病毒。5 仪器设备、用具及试剂材料5. 1 仪器设备天平(感量，1/10000 g)、离心机、组织捣碎机、低温冰箱等。5.2 用具微量移液器(2.5L、10L、20L、100L、200L、1000L)、研钵、离心管等。1 GB/T 28975-2012 5.3 试剂材料纳米颗粒增敏肢体金免疫层析法测定高宦花叶病毒试剂材料(见附录B)。6 实验步骤6. 1 生物安全与废弃物处理实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T 23629-2009中5.7进行处理。6.2 样晶制备称取1g植物或其产F离心10min.取
6、上清漉销鲁6.3 样本存放6.4 病毒检测6.4. 1 检测步骤/ 飞飞飞中分别测结果有效。如果质控线材不明颜色，或阳性对照检测线条带不出现颜色，或刚凡啦测线条带出现颜色6. 复清洗3次，每次1min.然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加入30L增敏试剂，室温反应5min8 min后，观察检测线条带颜色。6.4.4 结果判定检测线条带出现颜色，判定为阳性;检测线条带不出现颜色，判定为阴性。注2增敏前条带颜色为红色，增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色。7 结果的确认可疑阳性样品应采用高宦花叶病毒RT-PCR检测方法进行确认。2 8 样晶的保存与复核GB/T 28975-2012 种子类样品保
7、存6个月，如果发现带毒样品保存1年。植株中发现病毒的，采集病叶干燥后保存于一200C条件。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。复核程序按照GB/T23632-2009中第6章进行操作。/ 飞、王 . 川 / / / / / / / / 、. 飞飞飞-/ 3 GB/T 28975-2012 附录A(资料性附录)离宦花叶病毒相关资料A.1 寄主范围寄主范围很广，自然寄主有离宦CLactucasativa)、野高宦CL.seriola)、蓝琉璃繁缕CAndgallisar vensis)、鹰嘴豆CCicer arietinum)、红花CCorthamustinct
8、orius)、黎CCheno户odiumalbum)、墙生寨CC.murale)、芹叶幢牛儿苗CErodiumcicutariU1川、宝盖草CLamiumamplexicaule)、香豌豆CLathyrusod oratus)、小花锦葵CMalvaparviflora)、豌豆CPisumsativum)、欧洲千里光C5enecio vulgaris)、菠菜C5inacia oleracea)、繁缕C5tellariamedia)等;接种可侵染蔬菜、花卉和烟草中的10科植物。A.2 病害症状高宦症状多变，但通常表现为明脉和黄斑驳。感病表现明脉黄斑驳，常有叶脉坏死并呈古铜色。病株不能包心，里面的叶
9、片持续短小，呈丛簇状。鹰嘴豆CCicer arietinum):叶黄化。碗豆CPisum sativum):褪绿，叶斑驳。A.3 分布地区世界范围均有分布。A.4 传播方式该病毒可通过汁液、种子、花粉及介体蜻虫CAhisgossyII、Macrosihumeu抖orbiae、M.gei和Myzusersicae)传播。4 GB/T 28975-2012 附录(规范性附录)纳米颗粒增敏肢体金免瘟层析法测定离宦花叶病毒试剂材料B 肢体金免疫层析增敏快速检测试纸条样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标离宦花叶病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80%;硝酸纤维素膜
10、的检测线上包被了高宦花叶病毒多克隆抗体;质控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸。其结构见图B.l。B.1 样品流动方向袭警J 2沪3弘 线自引到自丁|制、翠建立工:!阳唰2吸水垫母三骂质控线如理2翠望:PVC背衬其中2玻璃纤维素片:吸水速率大于4s/cm，吸水量大于50mg/cm2; 硝酸纤维素膜(NC膜):毛细流动速率大于25s/cm; 吸水纸:吸水速率大于3s/cm，吸水量大于100mg/cm2 ; 聚氯乙烯(PVC)板z初粘力大于或等于3号球，持粘力标准条件下大于80h. 肢体金免疫层析增敏快速检测试纸条图B.1、 5 1 L 1. 3g 20 g 0.2 g 样品提取
11、缓冲液PBST 亚硫酸铀(NaZS03)PVP(MW24 00040 000) 叠氮铀(NaN3)4 .C储存。B.2 GB/T 28975-2012 B. 3 PBST缓冲液(洗涤缓冲班pH7.的氯化铀(NaCl)磷酸氢二铀(Na2HP04)磷酸二氢饵(KHzP04)氯化饵(KCl)吐温-20蒸馆水定容至1L。B. 4 增敏试剂8 g 1. 15 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL 将1%的氯金酸和10mmol/L的盐酸楚肢按1: 5的体积比混合，混合后5min内使用。B.5 阴性对照取1g的一200C下保存的健康叶片组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，40C离心10m
12、in (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阴性对照。B.6 阳性对照取1g的一200C下保存的灭活的病叶组织，用研钵液氮研磨粉碎，加入2mL样品提取缓冲液，40C离心10min (3 000 g5 000 g)，取上清液制备成阳性对照。6 也.4 NON!RmNHmo 华人民共和国家标准高宦花叶病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏肢体金免瘟层析法GB/T 28975-2012 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张O.75 字数12千字2013年3月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年3月第一版晤书号:155066 1-46399定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28975-2012 打印日期:2013年4月3日F002A
