1、每BICS 65.020.01 B 16 和国国家标准圭七中华人民GB/T 28978-2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus . k 2013-06-01实施2012-12-31发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会hJL肌/JKM G/T 28978-2012 目。自本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国植物
2、检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人:廖富荣、林石明、吴援、沈建国、吴志毅、陈青、张明哲、陈红运、黄蓬英。I G/T 28978-2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了基于生理生化特性、致病性特征、血清学、分子生物学特征的马铃薯环腐病菌检测和鉴定方法。本标准适用于马铃薯环腐病菌在马铃薯块茎、植株上的检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅
3、注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1135. 5-2007 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法3 马铃薯环腐病菌基本信息中文名称:密执安棒状杆菌环腐亚种俗名:马铃薯环腐病菌拉丁学名:ClaJibactermichiganensis subsp. seedonicus 属于微杆菌科(Microbacteriaceae)、棒形杆菌属(Clavibacter)的成员。马铃薯环腐病菌(以下简称Cms)引起马铃薯环腐病，可通过带病的种薯进行远距离传播，也报道可通过番茄等种子传播，关于Cms的其他信息参见附录Ao4 方法原理马铃薯环腐病菌具有独
4、特的培养性状和生理生化特征，该病菌的生理生化特性、致病性特征，以及血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。5 主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备z微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:O. 001 g)、生物培养箱、荧光显微镜、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、BIOLOG自动微生物鉴定系统、浊度计、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000L、200L、100L、20L、10L、2L)。6 检测与鉴定6. 1 症状检查马铃薯环腐病菌侵染马铃薯植株后，在马铃薯块茎、植株上可产生症状(参见附录A)，通过症状检
5、查可以初步判断是否为Cms引起的病害。GB/T 28978-2012 6.2 表现症状样品中南原菌的分离6.2.1 培养基的选择从马铃薯块茎、茎杆、叶片等植物组织中分离病原菌选择用MTNA培养基(见B.l)或NCP-88培养基(见B.2)，用酵母葡萄糖矿物盐培养基(YGM)(见B.3)或葡萄糖营养琼脂(NDA)(见B.的进一步纯化。6.2.2 分离纯化按附录E给出的方法，把疑似Cms的纯培养接种到BUG培养基(见B.7)上富集培养，然后接种到GEN m鉴定板上进行鉴定。6. 5 DAS-ELISA检测对于表现症状的植物组织样品，按1: 10的比例(质量=体积)在检测样品中加入样品提取缓冲液(见
6、B.10)，研磨成匀浆后，离心，上清液作为检测样品。对于已分离纯化的细菌纯培养，用样品提取缓冲液(见B.10)制备约106CFU/mL的菌悬液作为检测样品。对于潜伏侵染的植物组织样品，制成样品悬浮液后(见附录D)，用样品悬浮液进行检测。按试剂操作说明书或按SN/T1135.5一2007中5.2给出的试验方法。用Cms己知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照。GB/T 28978-2012 6.6 分子生物学检测6.6.1 PCR检测本标准提供多个检测Cms的PCR方法，任意选用其中一种PCR法进行检测，按F.1和F.2给出的方法。用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空白对照。6.
7、6.2 实时荧光PCR检测本标准提供2个检测Cms的实时荧光PCR方法，任意选用其中一种方法进行检测，按F.1和F.3给出的方法。用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空白对照。6. 7 致病性测定按附录G给出的方法，把培养3d的纯培养物制备成约106CFU/mL菌悬液，接种到510株茄子幼苗的茎杆上。用新鲜配制的马铃薯环腐病菌己知菌株制备成约05CFU/mL106 CFU/mL的菌悬液作为阳性对照，接种5株茄子幼苗。用无菌水作为阴性对照，接种5株茄子幼苗。7 结果判定与报告7. 1 结果判定7. 1. 1 当BIOLOG检测或DAS-EILS检测或分子生物学检测(PCR方法或实时
8、荧光PCR方法)，其中两种基于不同原理的方法检测结果为阳性、且致病性测定为阳性时，判定为马铃薯环腐病菌。7. 1. 2 当DAS-EILSA检测或分子生物学检测(PCR方法或实时荧光PCR方法)初筛检测结果为阴性，或只有其中一种检测方法结果为阳性时，判定为非马铃薯环腐病菌。7.2 结果记录与保存7.2.1 记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光PCR检测结果保存采集的数据。7.2.2 检出马铃薯环腐病菌的马铃薯块茎、茎轩、或叶片等样品，在超低温冰箱中保存，以备复核;分离纯化的马铃薯
9、环腐病菌保存到超低温冰箱中，或冻干后低温保存。3 G/T 28978-2012 附录A(资料性附录)马铃薯环腐病菌相关信息A.1 名称与分类地位中文名称:密执安棒形杆菌马铃薯环腐亚种、密执安棒形杆菌环腐亚种、密执安棍状杆菌环腐亚种、wilt英文缩写iCM$或Cms. 4) & 4) 分类地位:细菌界(Bac叫a).厚璧菌门(Firmicut时，放线菌纲Adnob叫出a)，放线菌亚纲CActinobacteridae) ，放线菌目CACtinomy0.75、DIS I 山.，-山一r-.，._，.子、;， 一.，.-/-.-.:.，.Il0l.，1，山1I TT ,. ,.,. , 一一在CR域
10、实时荧光PCR反应前，用磷酸缓冲液稀释10倍;一一取2正用于PCR或实时荧光/PCR反应。/ F. 1. 1.2 纯培养GB/T 28978-2012 / 一一对于具有症状的马铃薯块茎、叶片或茎杆等植物组织，从病斑上取0.1g的植物组织，研磨后，使用植物DNA提取方法或其他商用的DNA提取试剂盒提取总DNA。一一对于无症状的马铃薯块茎样品，取100L样品悬浮液(见附录。提取DNAoF.2 PCR检测F.2.1 引物及序列目前，有多对可用于特异性检测的PCR引物，引物及序列见表F.1。另外，引物N5-7-FC5-gag gcaataacaggtctgtgatgc-3)和NS-8-R C 5 -t
11、ccgcaggttcacctacgga-3 )是用于扩增植物内18SrRNA基因的引物，可作为PCR内对照，从马铃薯、茄子和番茄中扩增的DNA片段大小为377忡。13 GB/T 28978-2012 表F.1 用于马铃薯环腐病菌PCR检测的特异引物及序列引物名称引物序列(5-3)扩增大小目的基因参考文献PSA-1 ctccttgtggggtgggaaaa 502 bp IGS 9J PSA-R tactgagatgtttcacttcccc CMSIF1 tgtactcggcca tgacgttgg 1 066 bp IS1121 b 10J CMSIR1 tactgggtcatgacgttgg
12、t C岛1SIF2tcccacggtaatgctcgtctg 885 bp IS1121 10J CMSIR2 gatgaaggggtcaagctggtc CmsSplf ccttgtggggtgggaaaa l1J 215 bp IGS CmsSp5r tgtgatccaccgggtaaa Cms50F gagcgcgatagaagaggaactc 193 bp Cms50 12J Cms50R cctgagcaacgacaagaaaaatatg Cms72aF ctactttcgcggtaagcagtt 213 bp Cms72 12J ,13J Cms72aR gcaagaa tttcg
13、ctgcta tcc 16S -23S rRNA基因间隔区(Intergenicspacer region of the 16S -23S rRNA genes)。b pCS1质粒及染色体中的插入因子IS1121(Insertion element IS1121)。, Cms基因组序列中该亚种的特异性序列。F. 2. 2 PCR扩增25L的反应体积:2.5L10XPCR缓冲液(含Mg2+),0. 5L的dNTP(各10mmol/L) ，0.5L Taq DNA聚合酶，上游引物1L(lOmol/L)，下游引物1L(lOmol/L)，2L的DNA模板，17.5L的分子级H20。在PCR仪上完成反应
14、，反应程序见表F.2。所有检测样品都需重复一次。注1:当使用由引物PSA-1/PSA-R和NS-7-F/NS-8-R组成的多重PCR方法检测时，除特异引物外，还应加入另外一对引物PSA-1/PSA-R和NS-7-F/NS-8-R，并相应减少H20的体积，使总体积为25L。注2:引物CMSIF1/CMSIR1和CMSIF2/CMSIR2组成巢式PCR，先由CMSIF1/CMSIR1扩增后，再由CMSIF2/CMSIR2扩增。表F.2普通PCR反应条件引物对预变性反应循环总延伸Splf/ Sp5r 95 C , 5 min 94 c变性60s , 62 c退火45s , 72 c延伸90s;共40
15、循环72 C , 7 min PSA-1/ PSA-R 95 c , 5 min 95 c变性60s , 64 c退火60s , 72 c延伸60s;共10循环72 C, 7 min 95 c变性30s , 62 c退火30s , 72 c延伸60s;共25循环Cms50F / Cms50R 95 c ,5 min 94 c变性45s , 55 c退火60s , 72 c延伸10s;共10循环72 C, 7 min 94 c变性45s , 55 c退火40s，72C延伸15s;共40循环Cms72aF / Cms72aR 95 c , 5 min 94 c变性45s , 60 c退火60s ,
16、 72 c延伸15s;共10循环72 C, 7 min 92 c变性45s , 60 c退火40s , 72 c延伸20s;共40循环CelA-F/ CelA-R 95 c , 5 min 92 c变性30s , 60 c退火45s , 72 c延伸30s;共40循环72 C, 7 min CMSIF1/ CMSIR1 95 c , 5 min 94 c变性60s , 60 c退火60s , 72 c延伸60s;共35循环72 C, 7 min CMSIF2/ CMSIR2 95 c , 5 min 94 C变性60s , 60 c退火60s , 72 c延伸60s;共35循环72 C , 7
17、 min a引物序列见表F.3，扩增片段大小为150峙。14 GB/T 28978-2012 F.2.3 凝胶电泳PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5L的PCR产物与1L的6X上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5XTBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中，然后在120V下电泳。电泳结束后，在0.5g/f.LL的澳化乙链(EB)溶液中染色约5min，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。F. 2.4 PCR检测结果的判定在阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小的条带情况下:一如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性;如果检测样品未出现气阳
18、性对照大小一致的条p/-/ F.3 实时荧光PCRF. 3.1 引物及防千/ / 1. 使用Taj/M忡测系统，引物及时序列见表F.30/ / 表F.3实时荧光PCR所使用的引物引物阱(5的, 绥浓度引物名称/ 、/目的基因参考文献/ p.mol/L CelA-iF tctctcagt叩tgtaagatgat0.75 CelA-l a ttcgaccgctctcaaa / /0.75 Cllulas巳Aa13J . / celA probpb rAM-t问ggc山aggagtg叩gt:BHQl/ / 0.16 ! / Cms 50-2 牛agcgc军问aaga胆0.3 li! Cms 133R
19、 EEC手gcatcgctcagtacc。.314J Cms 50-53T ipx斗昭0.2 注:Taq Man时c卢讪叫CelAprobe也可以标记其他合适的报告魂的明腥团。b纤探团维针BH素zVQ酶端1A标基记因报告、基川吁元吁之rh吁:_nuor由ein(FAM)(荧光一盘一刻，/兴最:Y拉/长川r 517n时.3瑞标记标记猝灭基/ c探针:5端标记报告基团Hex(荧光发射最大波长553nm) ，3端标记标记猝灭基团BHQ1F.3.2 实时荧光PCR步骤25L的反应体积:10L2X定量PCR反应混合液，加入上下游引物及相应的TaqMan探针(使用量见表F.3)，2L的DNA模板，ddHz
20、O补足体积。所有检测样品都需重复一次。反应条件见表F.4。引物对及探针CelA-F/ CelA-R,CelA probe Cms 50-2F/ Cms 133R,Cms 50-53T 表F.4实时荧光PCR反应条件预变性95 c ,5 min 95 c ,5 rnin 反应条件95 c 30 s ,60 c 45 s ,72 c 32 s，共40循环95 c 15 s , 64 c 45 s，共40循环15 GB/T 28978-2012 F.3.3 实时荧光PCR结果的判定在阳性对照Ct值34，阴性对照和空白对照的Ct值二三40前提下=一如果检测样品的Ct值35时，则判定为阳性;一一如果检测
21、样品的Ct值二三40时，则判定为阴性;一一如果35Ct40时，则应重新测试。重新测试后，如果仍然为35Ct40，则判定为阳性。16 GB/T 28978-2012 G.1 t兑明附录G(规范性附录)生物学测定本附录规定的方法，一方面用于潜伏侵染样品的生物学测定，另一方面用于分离纯化后纯培养的致病性测定。G.2 测试植物的培育把感病的茄子种子播种在介质土中，待长到子叶完全展开(约10d14 d)，把幼苗转移花瓶中。待幼苗长至23叶期、第3真叶完全展开，用于接种。接种前的1d2 d不要给茄子浇水，以较少细胞压力。每个样品正常需要1525株的茄子植物。注:用于生物学测定的茄子应选择感病品种，如Bla
22、ckBeauty、LongTom、Balsa、Rima等。G.3 接种G. 3.1 接种前准备在接种前，最好准备一个长宽高为15cmX10 cmX 5 cm的盒子，并切开一个可以放置10cm的花瓶开口，用于接种时支撑(参见图G.l)。固G.1用于支撑及接种测试茄子的装置G.3.2 切开接种G. 3. 2.1 接种检测样晶把马铃薯块茎悬浮液(或菌悬液)接种到茄子苗上，每个样品接种1525株的茄子。具体操作如下:一一把准备接种的茄子苗水平放在支撑装置中，并在茎杆和盒子间垫上一张元菌的铝宿纸;一一在茄子子叶和第一片真叶之间的茎杆上，用无菌的解剖刀纵向切开一个长约o.5 cm1. 0 cm、深约为茎杆
23、直径四分之三的切口;17 GB/T 28978-2012 或者在茎杆上以约旷的斜角进行斜切，切口长约1.0 cm、深约茎杆直径的三分之二;注2解剖刀必需在70%酒精浸泡后、然后燃烧消毒，以避免交叉污染。一在切口上加入1滴(约5L10L)的马铃薯块茎悬浮液(见附录D)，或加入1滴约106 CFU/mL的菌悬液;一一用元菌的凡士林(或用1: 1配制的石蜡油和凡士林)封住切口。G.3.2.2 接种对照样品用已知的Cms菌株配制成105106的菌悬液，用相同方法接种5株的茄子，作为阳性对照。用元菌的10mmol/L磷酸缓冲液(见B.9)，使用相同的接种方法接种5株的茄子，作为阴性对照。G.3.3 注射
24、接种用元菌的注射器把马铃薯块茎悬浮液(见附录D)、或用纯培养制备的约106CFU/mL的菌悬液注射到子叶上方的茎杆中。G.4 培养与观察G. 4.1 把接种后的茄子苗放在18.C 24 .C的温室中，至少培养4周，并保证充足的光照(每天光照16 h)和湿度(最好高于70%)、以及充足的水分以避免因水分流失或缺少水分而萎焉。最适宜的温度是21.C。G. 4. 2 1周后定期检查症状，并计算显示症状的植物数量。Cms在茄子上引起叶片萎藉，可能开始于叶缘。萎焉组织可能最初显示暗绿色或斑驳，但在变坏死前转暗淡。脉间萎焉经常有油脂状的水渍出现，而坏死组织经常有一个明亮的黄色边缘。G.4.3 一旦症状出现
25、，按附录C给出的方法从萎焉的叶片或茎杆上重新分离。用70%酒精擦拭叶片和茎杆进行表面消毒。G.4.4 用PCR等方法对茄子汁液和重新分离的纯培养进行检测验证。或对重新分离的纯培养进行革兰氏染色。G.4.5 在某些情况下(特别是生长条件不理想情况下)，Cms可能以潜伏侵染形式存在茄子内，甚至在接种4周后也没有显示症状。如果观察到4周后还没有症状产生，在接种位置的上方切取1cm的茎杆，然后采用PCR等方法进行检测。如果检测结果是阳性的，则按附录C给出的方法重新分离。G.5 生物学测定结果的判定在阳性对照的茄子上显示出典型的症状，并且阴性对照的茄子上没有发现症状z一一如果接种的茄子未显示症状，且PC
26、R等方法检测结果为阴性，生物学检测结果则是阴性的;如果从接种的茄子上重新分离到Cms，生物学检测结果则是阳性的。18 1岛. . 4 GB/T 28978-2012 参考文献lJ 程池，杨梅，等.Biolog微生物自动分析系统一一细菌鉴定操作规程的研究.食品与发酵工业，2006 ,32(5):50-54. 2J 东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2001:267-277. 3J OEPPO/EPPO. EPPO Standard PM 7/59 (1): Clavibacter michiganensis subsp. sepedoni cus. Bulletin O
27、EPP/EPPO Bulletin,2006 ,36:99-109. 4J de la Cruz AR, Wiese MV &. Schaad NW. A semi-selective medium for the isolation of Clavibacter michiganensis subsp. seedonicus from potato tissue. Plant Disease , 1992 ,75: 830-834. 5 J J ansing H &. Rudolph K. Physiological capabilities of Clavibacter michigane
28、nsis subsp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Pathology, 1998 ,105: 590-601. 6J CAB International, 2005. Crop Protection Compendium, 2005 Edition. Wallingford, UK: CAB International. www. cabicompendium. org/cpc. 7J Palomo JL,Lopez M M ,Garcia-Benavides P ,Vela
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