1、 ICS 65.020.01 B 16 道B和国国家标准11: -、中华人民GB/T 28981-2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of odontoglossum ringspot virus 2012-12-31发布2013-06-01实施抄中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28981-2012 目lJr:=I 本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民
2、共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人:闻伟刚、陈先锋、杨翠云、郭立新、鲁洁、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。I G/T 28981-2012 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了齿兰环斑病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。本标准适用于种子、种球、花卉和种苗等植物材料中齿兰环斑病毒的检测，也适用于蜻虫等传播媒介中该病毒的检测。2 齿兰环斑病毒基本信息中文名:齿兰环斑病毒学名:odontoglossum ringspot virus 缩写:ORSV属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，齿兰环斑病毒其他信息参见
3、附录Ao3 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescent RT-PCR)进行检测鉴定。4 仪器设备、用具和试剂4. 1 仪器设备PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量:0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶
4、成像系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-800C)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪。4.2 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L、5000L)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等。4.3 试剂主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。5 检测5. 1 样晶制备取0.5g10 g种子、种球鳞片或畸形、变色症状的叶片等植物组织，在研钵或小型食品加工机中GB/T 28981-2012 充分研磨，取五分之一量的均匀后样品，转入离心管中，按1: 10(质量=体积)加入样品提取缓冲液振荡混匀。媒介昆虫按1: 10(质量=体积)加入样品提取缓冲液研
5、磨混匀。2000g离心10min，上清液即为DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。注:提取液在3h内使用，否则保存在4.C条件下。5.2 检测方法5.2.1 双抗体酶联免症眼附测定方法(DAS-ELISA)6 结果判定 ，结果均呈阳性，可判定样品携带齿车环在病毒/斗病毒。 / 、7 7. 限干J7.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括z样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定需有酶联反应吸光值的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。2 附录A(资料性附录)
6、齿兰环斑病毒相关资料A.1 名称中文名:齿兰环斑病毒学名:odontoglossum ringspot virus 缩写:ORSV分类地位:烟草花叶病毒属CTobamo时rus)。A.2 寄主范围GB/T 28981-2012 主要寄主是建兰CCymbidiumen叫声lium)、蝴蝶兰CPhalaenno扣issp. )、文心兰COncidiumsp. )等兰科COrchidaceae)植物。A.3 为害症状感染了ORSV的兰花，叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，花部甚至出现畸形或褪色斑，红色系花朵尤为明显。A.4 分布地区在世界各地均有分布。A.5 传播方式可通过元性繁殖材料、机械操作
7、携带汁液、甥虫等传播。A.6 粒体形态长约300nm，宽约18nm的杆状病毒，颗粒中轴可清楚分辨，部分病毒头尾相连。A.7 基因组ORSV粒体分散在细胞质内基晶格排列。内含体为X一体，病毒基因组6395 nt。沉降系数21 1. 6 S，核酸为单链RNA，相对分子质量2X 1060 3 GB/T 28981-2012 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫眼附方法(DAS-ELISA)B.1 试剂B. 1. 1 10 X PBST缓冲液(pH7.4) 1. 3g 2、og 0.2g Tween-20 J 20 时-/ 溶于900mL的1XPST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000 mL
8、，。 / B. 1.3 包被抗体摆;中液(pH9.6) / ,- / 碳酸铀(2Cq), 叮1. 59 g 碳酸氢铀(，aI-9p3)/ 2. 93 g / 川/ 溶解于900itnL.菌蒸健水中，用法盐酸(HCD调节p日至9.6，并定容至1制mt斗 j! 800 mL 2 g PVP(MW 24 00040 仍旧、二20g 二Z用灭菌蒸馆水定容至1000币L;-_ B. 1.5 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) 二乙醇胶97 mL NaN3 0.2 g 溶解于600mL的灭菌蒸馆水中，用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8，然后用灭菌蒸馆水定容至1000 mL。B.2 检测B. 2.1 包被
9、抗体用包被缓冲液将ORSV抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，室温孵育2h或4.C包被过夜。4 GB/T 28981-2012 B.2.2 加样清空酶联板孔中溶液，用PBST缓冲液清洗68次，在吸水纸上拍干。每孔加入100L制备好的样品检测粗提液，每个样品设2个重复。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照。室温孵育2h或4 oc过夜。B. 2. 3 加酶标抗体用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释。清空酶联板孔中溶液，用PBST缓冲液清洗68次，在吸水纸上拍干。每孔加入100L酶标抗体溶液，室温孵育2h。/ / ?;JTdjjJ 样品OD削/阴性对照OD4Q5值二泣，结果判定为阳性;
10、样品OD4Q5/阴性对照OD4Q5值2，判为阴性。5 G/T 28981-2012 C.1 主要试剂C. 1. 1 RNA提取试剂附录C(规范性附录)RT-PCR方法Trizol、三氯甲皖、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的ddH20。C. 1. 2 RT-PCR反应试剂一步RT-PCR反应试剂:AMV反转录酶(5U/L)、RNA酶抑制剂(40U/L)、AMV-OptimizedTaq聚合酶(5U/L)、10XRT缓冲液(含50mmol/L的Mg2个)、dNTP混合物(各10mmol/L)。C. 1.3 电泳缓冲渣TAE(50X) 三起甲基氨基甲:皖(Tris)242 g 冰乙
11、酸52.1 mL 乙二股四乙酸二纳(Na2EDTA.2H20)37.2 g 用灭菌蒸馆水定容至1000 mL。用时加灭菌蒸锢水稀释至1XTAE。C. 1.4 滇化Z链(E)溶液(10g/JLL) 澳化乙链灭菌去离子水C.2 RNA提取20 mg 20 mL C. 2.1 取100L样品检测粗提液到1.5 r此离心管中，再加入700LTrizol和200L三氯甲皖，上下颠倒混匀5min;4 .C 10 000 g离心10min，小心吸取上层元色水相到新离心管中。C.2.2 加入等体积异丙醇，混匀，4.C静置10min;4 .C 10000 g离心10min，弃上清液。C.2.3 加入700L70
12、%乙障清洗一遍沉淀。RNA沉淀干燥后，加入20L焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的ddH20溶解。注:在保证能够得到质量满意的总RNA情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。C.3 引物序到ORSV1:5人ttacagacccgtctaagctggc-3; ORSV2: 5 -caagtaagtccagacatcgtctc-3 。预期扩增片断长度为451bp. C.4 RT-PCR扩增反应体系如下:10XRT缓冲液(含50mmol/L的Mg2+)2.5L、dNTP混合物(各10mmol/L) 6 GB/T 28981-2012 2. 5L、RNA酶抑制剂(40U/L)0.5L、AMV反转录酶(5U
13、/L)0.5L、AMV-OptimizedTaq聚合酶(5U/L)0.5L、ORSV1引物(20mol!L)0.5L、ORSV2引物(20mol!L)0.5L、总RNAIL、RNasefree dH2 0 16. 5L，总体积25L。使用One-stepRNA PCR kit试剂盒或其他等效产品，也可采用两步法RT-PCR反应试剂，操作步骤按使用说明进行。每个样品设2个重复，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。反应条件:50.CcDNA合成30min , 94 .C预变性2min;94 .C变性30s , 60 .C复性30s，72.C延伸1 min，35个循环;最后72.C延伸5min。C
14、.5 琼脂糖凝胶电泳检测7 G/T 28981-2012 附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR方法D.1 实验步骤D. 1. 1 引物和探针序列引物序列:ORSV-TF: 5 -gggctgaccccaattcacta-3 o RSV -TR : 5 -a tcagcaaactgctgttgaacag-3 探针序列:ORSV-probe:5人FAM-accaattctctgggtaatcagttcca-Eclipse-3 D. 1.2 RNA提取操作方法见C.20D.1.3 实时荧光PCR反应体系反应体系如下:2 X One Step RT-PCR Buffer皿10L、20mol/L上下
15、游引物各O.6L、20 flmol/L荧光探针O.6L、50X ROX reference dye O. 4L、5U/ flL EX TaqTM HS O. 4L、PrimeScript RT Enzyme MixII 0.4L、总RNA1L、RNasefree dH20 6L，总体积20L。采用One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)或其他等效产品，也可采用两步法实时荧光RT-PCR反应试剂，操作步骤按使用说明进行。每个样品设2个重复，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。D.1.4 实时荧光PCR反应参数反应条件:420C5 m
16、in,95 oC 10 s;然后950C5 s , 60 oC 31 s，共40个循环。本反应条件适用于ABI7000型荧光PCR仪，如使用其他荧光PCR仪，可以根据仪器性能进行适当调整。仪器操作方法按照设备使用说明进行，反应结束后保存各项数据和图像。D.2 结果判定D. 2.1 阐值设定阔值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以阔值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。D.2.2 质控标准阳性对照的Ct值应30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验结果无效。阴性对照和空白对照元Ct值。GB/T 28981-2012 D.2.3 结果判定样品元Ct值并且无扩增曲线，判定为阴性。样品Ct值35.0
17、，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。样品Ct值在35.040. 0之间时，应重新提取样品总RNA进行扩增检测。重做结果元Ct值，判为阴性;否则判为阳性。9 NFON-NH阁。华人民共和国家标准齿兰环斑病毒检疫鉴定方法GB/T 28981-2012 国中峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)4 网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数18千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷句佬18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-46393 GB/T 28981-2012 打印日期:2013年4月27日F002A
