1、, . 哥ICS 65.020.01 B 16 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28982一2012番茄斑萎病毒PCR检测方法Detection of tomato spotted wilt virus by PCR 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2013-06-01实施发布G/T 28982-2012 目U昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准
2、主要起草人:于翠、杨翠云、廖富荣、易建平、邓丛良、戚龙君。I GB/T 28982-2012 番茄斑萎病毒PCR检测方法1 范围本标准规定了番茄斑萎病毒的RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于包括种子、苗木和元性繁殖材料的活体植物材料及传毒介体中携带的番茄斑萎病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 番茄斑萎病毒基本信息中文名z番茄斑萎病毒英文名:tomato
3、spotted wilt virus 缩写:TSWV 分类地位:布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)番茄斑萎病毒其他信息参见附录A。4 方法原理用特异性抗体修饰的磁株吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA，或直接从待测样品材料中提取植物总RNA，然后在逆转录酶的作用下合成cDNA，t;A cDNA为模板再通过普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行检测。分析PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分。5 仪器、用具及试剂5. 1 仪器设备PCR仪，实时荧光PCR仪，旋转孵育器，电泳仪，凝胶分析成像系统，水浴锅，高速冷冻离心机，高压灭
4、菌锅，微波炉，涡旋振荡器，电子天平(感量0.001g)，超低温冰箱(-80OC)等。5.2 用具磁力架，可调式微量移液器，无RNase吸头，无RNase离心管，PCR管，研钵等。5.3 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。试剂配制见附录B。番茄斑萎病毒抗体，磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子，直径280nm，表面标记有甲苯磺酷基), GB/T 28982-2012 Trizol或RNA抽提试剂盒，三氯甲饶，异丙晖，无水乙醇，无RNAase水，逆转录试剂盒，PCR反应相关试剂，漠化乙链，DNA相对分子质量标记(100bp2 000 bp)，琼脂糖等。6 抽样和样晶制备6. 1
5、症状观察现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，TSWV为害症状描述参见附录Ac6.2 抽样7 检测鉴定/ 进行病毒8.2样品经RT-PCR咱疫磁尊严PCR检测为阳性，需要进行向隅根序列测定结果证实与所9 样晶保存和结果记录9. 1 样晶保存经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子在干燥条件下保存6个月，其他繁殖材料在一200C保存，带毒介体则保存于一80oC。做好登记和标记工作。9.2 结果记录记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RT-PCR检测或免疫磁珠RT-PCR应有电泳结果照片及序列测定报告，实时荧光R
6、T-PCR应有扩增曲线图片等。2 GB/T 28982-2012 附录A(资料性附录)番茄斑萎病毒相关资料A.1 生物学特性A. 1. 1 主要寄主番茄斑萎病毒的寄主范围很广，可侵染70个科925种植物。主要寄主包括:番茄CLyco persicon esculentum)、辣椒CCasicumannuum)、高宦CLactucasativa)、豌豆CPisumsativum)、烟草CNicotianatabacum)、马铃薯CSolanum tuberosum)、凤梨CAnanascomosus)、落花生CArachishypogaea)、刀豆CCanavalia gladiata)、寂麻(
7、Crotalariajuncea)、大豆CGlycinemax)、向日葵CH elianthus annuus)、假酸浆CNicandrahysaloides)、菜豆CPhaseolus vulgaris)、灯笼果CPhysalis peruviana)、茄子CSolanum melongena)、灰毛豆CTehrosiaurpurea)、蚕豆CViciafaba)、黑吉豆CVignam ungo)、绿豆CVigna radiata)、虹豆CVigna unguiculata)、百日菊CZinnia elegans)、六出花CAlstroemeria aurantiaca)、银莲花CAnemo
8、necathayensis)、旱芹CApiumgraveolens)、秋海棠CBegoniaevansiana)、冬瓜CBenincasa hispida)、番木瓜CCaricaya)、菊宦CCichorium intybus)、鹰嘴豆CCicer arietinum )、西瓜CCitrullus lanatus)、翠菊CCallistehuschinensis)、长春花CCatharanthus roseus)、黄瓜CCucum is sativus)、西葫芦CCucurbita pe0)、树番茄CCyphomandra betacea)、莱茵CCynarascolymus)、大丽花CDah
9、liapinnata)、紫色洋桔梗CEustoma russellianum)、橡胶树CFicus elastica)、薛荔CFicusumila)、非洲菊CGerberajamesonii)、辣子草CGalinsogaarviflora)、棉属CGossylumLinn. )、凤仙花属CI m patiens Linn. )、家山萤豆CLathyrussativus)、羽扇豆CLuPinuspolyphyllus)、辣薄荷CMenthaerita)、文心兰属COncidium)、蝴蝶兰属CPhalaenopsisBlume)、佛手瓜CSechiumedule)、大岩桐CSinningia s
10、peciosa)、葡萄CVitis vinifera)、马蹄莲CZantedeschia aethioPica)、碧冬茄属CP etunia J uss. )、菊花CDendranthema morifolium)、天堂葵CPelargonium hortorum)、罗勒COcimum basilicum)等。A. 1. 2 野生寄主杂草也是番茄斑萎病毒及其传毒介体重要的中间宿主，主要包括:刺克CAmaranthussinosus)、繁缕CStellariamedia)、事CChenoodiumalbum)、牛葬CArctiumlapa)、三爷鬼针草CBidenspilosa)、辣子草CGal
11、inosogaparvi，ora)、苦宦菜CSonchus oleraceus)、芥菜CCasellabursa-storis)、草木犀CMel讪usofficinalis)、小花草葵CMalva parviflora)、匙叶草CLimonium latifolium)、马齿克CPortulaca oleraceae)、龙葵CSolanum nigrum)、旱金莲CTropaeolum majus)、马鞭草CVerbenalitoralis)等。A. 1. 3 受影晌的植物部分整株、叶片、果实/英。A. 1.4 危害症状TSWV的危害症状，即使是在同一寄主植物上，也会因品种、年龄、营养状况和环
12、境条件的不同有很大差异，该病毒在一些重要经济作物和观赏植物上产生的症状如下z番茄上的症状:叶子呈青铜色、卷曲、出现坏死条纹和斑点，叶柄、茎和茎尖也产生黑褐色条纹。与健康植株相比，被害植物矮小。红色或黄色的番茄成熟时表皮出现暗红色和黄色块斑。坏3 GB/T 28982-2012 死严重时，能够导致植株死亡。偶尔症候仅在水果上发现。一一辣椒上的症状z植株矮化和黄化，叶片出现褪绿线纹或花叶并伴有坏死斑，茎上坏死条纹从茎部蔓延至枝端。成熟果实产生黄化，伴有同心环或坏死条纹。离宦上的症状z植株受害后，从一侧叶子开始出现褪绿并产生褐色斑块，接着中央叶片开始褪色，之后这一侧植株停止生长产生特征性的变形。一一
13、花生上的症状:表现为芽坏死，叶片褪绿和植株死亡。菊花上的症状:不同品种症状差异较大，常见的症状有茎黑色条纹和萎藉，Gloxinia品种的菊花被害症状是产生黄色或褐色叶斑或叶片转为标叶状。凤仙花上的症状:一些受INSV和TSWV感染的新几内亚杂种的栽培品种出现矮化，叶基变黑或叶片出现褐色叶斑。一一大岩桐上A. 1.5 传毒方式 一午._.二豆、4二，一町、，-I_:卢、和1种管前马科C!i;thritfldorsalis)昆虫介体。前马若虫获毒，成虫不能获毒，但只有战虫才能传毒，介体有的可以终生带毒。二;f-里光属植物和番茄种子可以带毒，但仅发现1%是感染性的摘毒带在外种皮上A.2 分布JJ J
14、 / / / 欧洲z比利时、保加利亚克罗地亚、捷克、丹麦、芬兰、法国、德国;希腊、克里特岛、匈牙利、爱尔兰、意大利、立陶宛、马耳他、摩尔达维亚、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙人罗马亚、俄罗斯远东及南部、斯洛伐克、西班牙、加纳利群岛、瑞典、瑞士、英国、南斯拉夫pJ/ 亚洲:阿富汗、亚美尼亚、阿塞拜疆、甲国四川、云南和?东、中国台湾、塞浦路斯、印度、以色列、北海道、土耳其、乌兹非洲:阿尔及利亚与刚果民主共和国、埃及、利比亚、马达加斯加、毛里求斯、摩/洛哥、尼日尔、尼日利亚、塞南美洲:阿根廷边利维韭、巴西、智利、圭亚那、海地、牙买加、马提尼克if巴拉羞波多黎各、乌拉圭、委内瑞拉。北美洲z大洋洲:A.3 粒
15、体形态 病毒粒子为球形，直径约为85nm，表面有一层膜包裹，膜外层由5nm厚几乎连续的凸起层组成。A.4 基因组三分体基因组，其中ssRNA-L为负义，ssRNA-M和ssRNA-S为双义，各个基因组片段具有末端序列，在3端是UCUCGUU.，在5端是AGAGCAAU.，区域互补而形成锅饼状结构。番茄斑萎病毒的L片段编码一个332kDa的多聚酶;M片段的互补链RNA编码两个糖蛋白G1和G2，病毒链RNA编码33.6kDa非结构蛋白NSm;S片段的互补链RNA编码28.8kDa外壳蛋白，病毒链RNA编码52.4kDa非结构蛋白NSs.4 B.1 样晶抽提缓冲液(pH7.4)附录B(规范性附录)试
16、剂配制亚硫酸铀(NaZS03)1. 3 g 聚乙烯基毗咯皖酣(PVP，MW 24 00040 000) 20 g 叠氮铀(NaN3)Tween-20 0.2 g 20 mL 溶于900mL的1XPBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000mL。B.2 酶标抗体缓冲液(pH7.4)1XPBST缓冲液牛血清白蛋白(BSA)PVP(MW 24 00040 000) 用无菌蒸锚水定容至1000mL。B.3 电泳缓冲液TAE(50X) 三是甲基氨基甲:皖(Tris)冰乙酸乙二肢四乙酸二铀(EDTAO. 5 mol/L) 用时加蒸锢水稀释至1XTAE。B.4 漠化乙链(EB)溶液(10g/p.L)
17、 澳化乙键灭菌去离子水B.5 缓冲液A(0.1mol/L磷酸铀缓冲液pH7.4)磷酸二氢铀(NaHzP04)磷酸氢二铀(NazHP04)溶解于去离子水中，最后定容至1000mL。B.6 缓冲液B(0.1mol/L珊酸缓冲液pH9.5)800 mL 2 g 20 g 242 g 52.1 mL 100 mL 20 mg 20 mL 2. 62 g 14.42 g 棚酸(H3B03)6.183 g GB/T 28982-2012 溶解于800mL去离子水中，以5mol/L NaOH调整pH至9.5并定容至1000 mLo 5 GB/T 28982-2012 B.7 缓冲液C磷酸盐缓冲液(含O.1
18、%BSA) pH 7. 4J 氯化铀(NaCl)0.88 g 牛血清白蛋白(BSA)0.1 g 溶解于80mL 0.01 mol/L磷酸铀缓冲液中pH7.4，彻底混匀并定容至100mL。B.8 缓冲液DO.2 moI/L Tris pH8. 5 with O. 1 %质量浓度BSAJ2.42 g Tris溶于80mL去离子水中，用1mol/L HCl调整pH值至8.5。然后加入O.l%BSA至100 mLo 6 GB/T 28982-2012 C. 1 引物附录C(规范性附录)RT-PCR方法TSWVCP-F: 5 -GCTTTGTTGACACAAGGCAAAGACC-3 TSWVCP-R:
19、5 -GGCAAGCCTCACAG ACTTTGCA TC-3 扩增片段长度为390bp。C.2 植物总RNA的提取C. 2.1 取1g样品，放入研钵后加人液氮研磨至细粉，然后取o.1 g放入灭菌离心管中，加入1mL Trizol，混匀。C.2.2 加入0.2mL三氯甲:院，猛烈振荡15s,4 .C 11 000 g离心10min，小心吸取上层元色水相到新离心管中。C.2.3 加入等体fR异丙醇，混匀，一20.C静置10min, 4 .C 12 000 g离心15min，保留沉淀。C.2.4 加入1mL 75%预冷乙醇，悬浮沉淀，4.C8000 g离心10min，干燥沉淀。C.2.5 加入30
20、LDEPC-H20，溶解沉淀(必要时，55.C60 .C水浴10min，加速溶解)。若不能立即使用建议保存于一80.C冰箱备用。注:或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作。C.3 cDNA第一链的合成反应体系20L，其中2L模板RNA，lL反向引物(20mol/L)，4L 5XAMV酶缓冲液，2L dNTPOO mmol/L) , 1LAMV反转录酶(5U/L)，lL RNAase抑制剂，9L无RNAase的水。42.C反应1h. C.4 PCR反应PCR反应体系见表C.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含番茄斑萎病毒材料的cD
21、NA或含有番茄斑萎病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。反应条件:94.C 4 min;94 .C 30 s、58.C30 s , 72 .C 45 s、30个循环;72.C 10 min延伸。取10L扩增产物与2L的6X上样缓冲液棍合均匀，在0.5XTAE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶中，4V/cm6 V/cm电泳30 min，澳化乙链(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。7 GB/T 28982-2012 表C.1RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量L PCR缓冲液10X lX 2.5 dNTP 2.5 mmol/L 200m
22、ol/L 2 上游引物10 !Lmol/L 0.2mol/L 0.5 下游引物10mol/L 0.2mol/L 0.5 Taq酶5 U/L 0.05 U/L 0.25 cDNA 1. 5 无菌水17.75 总体积25 C.5 结果判定C.5.1 阳性对照在390bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品在390bp处无条带，则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性。C.5.2 阳性对照在390bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与番茄斑萎病毒的序列同源，则可判定样品为番茄斑萎病毒阳性，若序列
23、不同源，则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性。8 GB/T 28982-2012 附录D(规范性附录)免症磁珠RT-PCR方法D.1 免瘟磁珠分离D. 1. 1 磁珠的清洗D. 1. 1. 1 将装有纳米磁珠的瓶子j涡旋混匀1min，过程中避免面现泡沫。D. 1. 1.2 D. 1. 1. 3 D. 1. 1. 4 . 1. 1.5 D. 1. 1.6 D. 1.2抗 D. 1.2. 1 计算抗体和磁珠使用浓度，推荐按照3月抗体/107，磁珠的浓度进行包被，但此浓度仅为推荐浓度，不同来源的抗体包被浓度可能不同。/D. 1.2.2 向含有适量清洗后的磁珠的离心管中加入100L约3阔的抗体，用枪头轻轻吹
24、打，使之成为均一的悬浊液。、/ / l D. 1.2.3将此悬浊液置3盯7.C过夜(16f18 h)，过程中始终保持离心管的旋转摒荡，避免磁珠沉淀到:Ti?;响i嚣盟踹32器;骂i乞￥试管白酌牛架耻如上1:2叫磁珠酣柑监幢叫壁D. 1. 2. 5 将包被有体的磁珠按以下步骤清洗比:/ 一加入缓冲C，4c清洗5min，2次; 二加入缓冲、置3盯已清洗4h; 加人缓冲液C主仁C清洗如5min肌n.。, . 1. 2. 6 已经包被抗体的磁珠耳以直接用于抗原吸附。若暂时J的温度条件下可保存数月，为避免滋生细菌，可加0.02%的叠翩。注:该体系可根据需要自行调整。D. 1.3 抗原吸附D. 1.3.1
25、 将样品或阴性对照和阳性对照用病毒提取缓冲液稀释备用。D. 1. 3. 2 取病汁液加入到包被有抗体的磁珠中，用枪头轻轻吹打1min，混合均匀。D. 1.3.3 将此悬浊液置37.C孵育器中2h，过程中始终保持离心管的旋转振荡，避免磁珠沉淀到管底，影响吸附效果。D. 1. 3. 4 将包被好抗原的磁珠放于磁力架上吸附2min左右，待磁珠贴壁，液体部分澄清透明，去除清液，备用。D. 1.3.5 将吸附好抗原的磁珠用元RNase的水漂洗，5000 g 30 s离心沉淀磁珠。9 GB/T 28982-2012 D.2 cDNA第一链的合成直接在吸附了病毒的带有磁珠的离心管中进行反转录。反转录体系总体
26、积为20L，其中1L反向引物(20mol/L)，4L5XAMV酶缓冲液，2LdNTPC10mmol/L) ，11L无RNAse的水，稍离心混匀后置于85.C孵育器中变性5min，迅速置冰上2min3 min，然后迅速加入1LAMV反转录酶(5 U/L) ，1LRNA酶抑制剂(40U/L) ,42 c反应1h。D.3 PCR反应具体步骤见C.4D.4 结果判定D. 4.1 阳性对照在390bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照元特异性扩增，待测样品在390bp处元条带，则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性。D.4.2 阳性对照在390bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对
27、照一致的扩增条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与番茄斑萎病毒的序列同源，则可判定样品为番茄斑萎病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性。10 GB/T 28982-2012 附录E(规范性附录)实时荧光RT-PCR方法E.1 引物(引自Boonhamet aI. ,2002) E. 1. 1 TSWV检测引物和探针E. 2 RNA提取/ / E. 2.1 植物RNA提取良、.，加入50LDEPC处理水(在冰上操作)侵软。每个样品中加见附录C.3。E.4 实时荧光RT-PCR反应PCR反应体系见表E.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或
28、不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含番茄斑萎病毒材料的cDNA或含有番茄斑萎病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。反应参数:95oc; 预变性10min;95 oc; 15 5 ,60 oc 1 min，40个循环。11 GB/T 28982-2012 表E.1 实时荧光PCR反应体系试剂贮备液浓度终浓度加祥量L PCR缓冲液10X 1X 2.5 MgC12 25 mmol/L 3.0 mmol/L 3 dNTP 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 TSWV-CP-17F 20 /lmo1/L 0.15mol/L 0.3 TSW
29、V-CP-100R 20 /lmo1/L 0.15mol/L 0.2 WFT-RNA-25F 20mol/L 0.15mol/L 0.2 WFT-RNA-93R 20mol/L 0.15mol/L 0.2 TSWV-CP-73T(FAM标记)20mol/L 0.15mol/L 0.2 WFT-RNA-48T(VIC标记)20mol/L 0.15mol/L 0.2 Taq酶5 u;L 0.04 U;L 0.2 cDNA 2 补水至25 E. 5 结果判定E.5.1 阁值设定:闰值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以闰值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。E. 5. 2 待测
30、样品的Ct值为40或元Ct值时，则判定未检测到番茄斑萎病毒。E.5.3 待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定检测到番茄斑萎病毒。12 飞GB/T 28982-2012 参考文献lJ Boonham，风，Smith，丑，Walsh，瓦，Tame，上，Morris , J. , Spence，风，Bennison, J. , Barker, 1. , 2002. The detection of Tomato spotted wilt virus CTSWV) in individual thrips using real time fluorescent RT-PCRCTaqMan) , J
31、ournal of Virological Methods. 101 :37-48. 13 -hpd胃NFON|NNH阁。华人民共和国家标准番茄斑萎病毒PCR检测方法GB!T 28982-2012 国由4 导中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数26千字2013年4月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年4月第一版导书号:155066. 1-46391 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28982-2012 打印日期:2013年4月23日F002
