1、ICS 65.020.01 B 16 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 29577-2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法Detection and identification of Ditylenchus destructor Tborne 2013-07-19发布2013-12-06实施fT费17事中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局也士料J中国国家标准化管理委员会。叩GB/T 29577-2013 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国
2、深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人z江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣、赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇。I GB/T 29577-2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法1 范围本标准规定了腐烂茎线虫CDitylenchusdestructor Thorne)的检疫鉴定方法。本标准适用于蔬菜和花卉的块茎、鳞茎、球茎等根茎部分，其他寄主植物种子、茎、叶及栽培介质中腐烂茎线虫的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1141-2002 鳞球茎
3、茎线虫检疫鉴定方法SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程SN/T 1158 进出境植物盆景检疫规程SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 腐烂茎钱虫基本信息中文名z腐烂茎线虫z马铃薯腐烂茎线虫。英文名:potatorot nematode;tuber rot nematode o 学名:Ditylenchus destructor Thorne, 1945 0 腐烂茎线虫隶属于线虫门NematodaCRudolphi , 1808) Lankester, 1877 ，侧尾腺纲Secernenteavon Linstow, 1905、垫刃目TylenchidaThorne, 19
4、49、粒线虫科AnguinidaeNicoll , 1935 (1926)，茎线虫属Ditylenchus Filipjev，1936。腐足茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及栽培介质进行远距离传播。腐烂茎线虫的其他信息参见附录A。4 方法原理采集疑似寄主植物材料进行线虫分离，用显微镜观察分离到的线虫，依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫的形态学特征进行形态学鉴定，双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段。5 仪器用具5. 1 仪器生物显微镜(100X1 OOOX)、体视显微镜(10X80X，具透射光源、冰箱、电热恒温箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机(1000 r/
5、min5 000 r/min)、纯水仪。5.2 用具改进型漏斗分离器、移液器(10L、25L、100L、1000L);其他用具参见SN/T1141-2002中GB/T 29577-2013 的第3章所列的用具。6 试剂6. 1 形态学鉴定用试剂参见SN/T1141-2002中的第4章所列试剂。6.2 分子栓测试剂WLB (500 mmol/L氯化饵、10mmol/L T丘吉盐酸、pH8.0、15mmol/L氯化镜、1.0 mmol/L DTT、4.5%吐温20)、蛋白酶K(6mg/mL)、10XPCR缓冲液(20c保存、25mmol/L氧化钙溶液(-20c保存)、dNTP(10 rnmol/L
6、)、T吨酶(5U/L，-20 .C保存)、6X载样缓冲液、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、澳盼蓝载样缓冲液(6XTAE缓冲液，60%甘袖，0.3%澳酣蓝;4 c保存、澳化乙键(EB，避光保存、DNAladder marker( - 20 c保存、DNA凝胶回收试剂盒(室温保存)、EcoR1酶(-20 c保存)、大肠杆菌DH5a感受态细胞(一70.C保存)、质粒提取试剂盒(室温保存)。7 现场检测7. 1 检查对植物进行检查，注意植物地上部分是否有生长不良，叶色失绿、黄化，植株矮化等症状s块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤，做好记录，
7、写上标签，带回实验室检验。7.2 抽样应有针对性地抽取具有可疑症状的样品，分别用塑料袋装好，加贴标识;带回实验室后，打开袋口透气，适当保温，放在20C25 oC室内待检。对于元可疑症状的样品则按要求随机抽样，具体抽样比例按照SN/T1157、SN/T1158和SN/T2122 中的规定进行抽样。8 实验室检验8. 1 线虫分离采用两种方法进行分离:洗盘分离法按照SN/T1141-2002中B.2中对对线虫分离的要求进行，改进型漏斗法参见附录Bo8.2 标本制作见SN/T1141-2002中的附录Co8.3 显微观察、描述和测计在显微镜下，对线虫进行形态观察、描述和测计。8.4 分子生物学检测对
8、形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测(见附录C)。2 GB/T 29577-2013 9 形态学鉴定9. 1 茎钱虫属形态鉴定特征9. 1. 1 总则茎线虫属的雌虫和雄虫，其尾形非常相似，呈长圆锥形到近柱形，偶尔丝状，多数c(尾长胆门或泄殖腔处体宽)为47，寄主不形成虫瘦。9. 1. 2 雌虫9. 1. 2. 1 体表特征虫体一般较纤细，略弯曲，长O.6 mm1. 5 mm，表皮有很细的环纹，侧区有46条侧线。9. 1.2.2 内部特征口针细小，多数长度为7ml1m;中食道球有或元瓣，偶尔元明显的中食道球，峡部与后食道腺之间无缝缩，后食道腺短或长，不覆盖、短覆盖或长覆盖肠。9.
9、1.2.3 生殖系统特征雌虫单生殖腺、前伸，卵巢短或长，有时伸达食道区或转折，卵母细胞一行至两行排列，子宫柱状部有四排细胞(每排四个细胞)。有后阴子宫囊，且与虫体中线垂直。9. 1. 3 雄虫雄虫体表特征和消化系统特征与雄虫相似。雄虫精巢不转折，精细胞大(通常直径3m5m)，交合伞延伸至尾长的1/43/4处，从不伸达尾顶端。交合刺窄细，基部宽大，其上具特殊的突起。9.2 腐烂茎钱虫形态鉴定特征9.2. 1 雌虫9.2. 1. 1 体表特征温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲，有细微的环纹，体宽约1m，!lJ线六条，在虫体两端渐减为两条:唇区低平，略缝缩，唇区框架进行程度较高，侧器孔位于侧唇片。
10、9.2. 1.2 内部特征口针长度常约为10m14m，针锥常占口针长度的45%50%;口针基部球清晰、圆形，前表面向后斜。中食道球纺锤形，肌肉发达，有瓣，食道狭部窄，神经环包围处开始膨大为棒状的食道腺体E食道腺延伸、从背面稍覆盖肠的前端一小段偶尔维缩h偶然亦能见到后食道腺分枝(叉)。排泄孔位于食道腺位置;半月体刚好在排泄孔前方。3 GB/T 29577-2013 9.2. 1. 3 生殖系统特征阴门清晰、横裂，位于虫体后部，成熟雌虫的阴唇略隆起，阴门裂与体轴线垂直，阴门宽度占4个体环。卵巢发达、前伸、达食道腺基部，前端卵原细胞双行排列。卵长椭圆形，长度约为体宽1.5倍。后阴子宫囊大，延伸至虹阴
11、距2/34/50直肠和脏门明显，尾长约为虹门部体宽的3倍5倍。尾锥形，稍向腹部弯曲，末端窄圆。9.2.2 雄虫虫体比雌虫短而细，前部形态与雌虫相似，经热杀死后体直或向腹面弯曲成弓形。尾比雌虫的尾部略牢，且末端尖圆F单精巢前伸，前端可达食道腺基部。泄殖腔隆起，交合伞起始于交合刺前端水平处，向后延伸达尾长3/4;交合剌戚对，长24m27m，向腥面弯曲，前端盘苦大具指状突;I带短、简单。9.3 腐烂茎结虫形态特怔圄参见附录D。9.4 测计值表1列出了腐烂茎线虫雌虫和雄虫形态测计值q表1腐提茎结虫形态测计值L St N 数据来源a b C V T 口1mm 条Thorne 雄虫0.81-1. 40 3
12、035 8-10 li-20 78-83 (1945) 雄虫0.80-1.30 34-40 78 12-16 Goody 雌虫0.69-1.89 |1949 4-12 9-30 73-90 237 一-一一(1952) 雄虫0.76-1. 35 24-50 4-11 11-21 40-34 231 Brzesk 雄虫O. 691. 89 18-49 4-12 14-20 77-84 10-13 (1991) 雄虫0, 63-1. 35 24-50 4-11 11-21 10-12 / 注zN一一测计的线虫样本数目zL 虫体体长(单位为m或mm，头端至尾端的长度，不包括尾尖突); St 口针长度
13、单位为m); a一一体长/最大体宽zb -一体长/.!体前端至食道腺与揭连接处的距离;c一一体长/尾t幻T一一泄殖腔开口至精巢末端的距离XI00/体长;V一一虫体前端至阴门的距离X100/体*.9.5 腐炬茎钱虫与两种近似种的区别表2列出了腐烂茎线虫与其他两种常见的茎线虫的形态区别对照。4 GB/T 29577-2013 表2茎结虫属三种常见钱虫的主要形态区别对照表种别项目腐烂茎线虫鳞球茎茎线虫蘑菇茎线虫Ditylenchus destructo D.disacl D. myceliohagus 侵染部位主要是地下部分，偶见地上部分地上和地下部分蘑菇菌丝寄生专化性高等植物和真菌专性寄生高等植物
14、真菌是否产生线虫毛不产生产生不产生侧线数目6 4 6 食道与肠覆盖程度覆盖不瞿盖覆盖交合刺有元指状突起有无不详尾部末端形状钝尖锐尖钝尖卵原细胞排列情况双行或多行单行单行卵的平均长度与虫体宽相近虫体宽的2倍-3倍约虫体宽的2倍后阴子宫理与JJI阴距比2/3 1/2 1/2 中食道球形状纺锤形纺锤形纺锤形10 结果判定符合9.2中描述的形态特征的线虫，可鉴定为腐烂茎线虫F或者符合第9章形态特征的疑似线虫，经8.4中的分子生物学检测，采用通用引物扩增获得的PCR产物分别约为940bp( A型腐烂茎线虫)和1100 bp( B型腐烂茎线虫)，经特异性引物扩增的特异性片段约为252bp( A型腐烂茎线虫
15、和485 bp( B型腐烂茎线虫)，阴性对照元产物时，也可判定检测的线虫是腐烂茎线虫。11 样晶保存11. 1 植物材料保存对已经检出带有腐烂茎线虫的植物材料、土壤或栽培介质等，经登记后，要保存在低温干燥、防鼠防虫处，并注明样品编号、截获日期、截获地点、截获人、寄主名称、运输工具名称、来源国等，样品需至少保存一年，有特殊要求可适当延长保存期。11.2 线虫标本保存11. 2. 1 钱虫样本的保存如果鉴定为腐烂茎线虫，经线虫固定液固定后置于有4%甲醒溶液的指形管内，在4(:冰箱内长期保存，并标上样品编号、制作时间和制作人等相关信息。5 GB/T 29577-2013 11. 2. 2 玻片标本和
16、实验数据的保存经杀死固定后的线虫，可制作成线虫永久玻片标本，保存相关的特征描述及测量数据、绘图或照片;同时，应保存相关分子生物学鉴定的文件化试验结果，如z鉴定结果所依据的凝胶照片。6 GB/T 29577-2013 附录A(资料性附录腐烂茎结虫其他信息A.1 地理分布EPPO地区z阿尔巴尼亚、奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、捷克共和国、爱沙尼亚、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、拉托维亚、立陶宛、卢森堡、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯(欧洲部分、斯洛伐克、西班牙、瑞典、瑞士、土耳其、英国。亚洲z阿塞拜疆、中国(辽宁、吉林、河北、江苏、安徽、河南、山东等、伊朗、孟加拉国、日本、哈萨克斯坦
17、、沙特阿拉伯、塔吉克斯坦、土耳其和乌兹别克斯坦。非洲z南非。北美洲z加拿大、墨西哥和美国阿肯色、加利福尼亚、夏威夷、爱达荷、印地安那、新泽西、北卡罗莱纳、俄勒冈、弗吉尼亚、华盛顿、西弗吉尼亚和威斯康星州)。南美洲z厄瓜多尔。大洋洲z澳大利亚(新南威尔士、维多利亚、南澳大利亚、西澳大利亚、塔斯马尼亚州局部分布)、新西兰(仅危害蛇麻草)。A.2 寄主范围腐烂茎线虫的寄主范围很广，能够寄生于包括马铃薯在内的大约120多种作物和杂草、40个属70余种真菌中。A. 2.1 寄主植物腐烂茎线虫危害的主要寄主植物有以下种类:马铃薯CSolanumtuberosum L. )、莺尾CIrisspp.)、郁金香
18、CTulipa gesneriana L.)、风信子CHyacinthus orientalis)、唐富蒲CGladiolus hybridus Hort. )、大丽花CDihliapinnata)、巢菜属CNeottopterisspp. )、甜莱CBetavulgaris)、胡萝卡CDaucuscarota spp. Sativus)、欧芹CPetroselinum crisum)、红车轴草CTrifolium pratense L.)、白车轴草CTrifolium repens Linn. )、杂种车轴草CTrifoliumhybridum L. )、洋葱CAlliumcea)、大蒜CA
19、lliumorrum)、芹菜CAiumgraveolens L. )、黄瓜CCucumissativus L. )、西葫芦CCucurbitaoL.)、大豆Glycinemax CL) Merr. 、鹰嘴豆CCicer arietium L.)、花生(Arachishypogaea)、紫首宿(Medicago sativa)、蚕豆CViciafaba Linn.)、向日葵CH elianthus annuus)、大黄属CRheumspp. )、蛇麻草属CMumulusspp. )、甘薯CIomoeabatatas Lam. )、番茄(Solanumlycopersicum)、烟草CNicoti
20、ana tabacum L. )、甘藤CSaccharumofficenarum L. )、大麦CHordeumvulgare)、小麦(Triticumaesti vum L.)等。A.2.2 寄主真菌在元高等植物存在时，腐烂茎线虫能在真菌菌丝上繁殖，真菌寄主包括蘑菇属(Agari，tsspp.)、交链抱属(Alternariaspp. )、密环菌属(Armillariaspp.)、葡萄抱属(岛trytisspp. )、头霉抱属p加los如切nsp川、柱抱属(Cylindrocarponspp.)、曲霉属(Aspergillusspp. )、镰抱属CFusariumspp.)、青霉属CPeni
21、cillium spp.)、茎点属(Phomaspp. )、棘壳抱属(Pyrenochaetaspp. )、木霉属(Tric，加d矿maspp.)、轮枝菌属。伽-GB/T 29577-2013 ticillium spp. )等。A.3 危害症状腐烂茎线虫是一种迁移性植物内寄生线虫。腐烂茎线虫主要侵染植物的地下部分，极少危害植物的地上部分。引起茎的矮化、增厚和分叉，引起叶的矮化、卷曲和失绿(如在马铃薯上)。线虫通过寄主的匍匍茎或块茎的皮孔和薯眼进人，早期的症状是表皮下面有一小的白色斑点，去皮后肉眼可见。此后随着侵染部位的扩大，融合成谈褐色病变，病变部位含有干的颗粒状组织，在表皮下可见。随着侵染
22、的发展，组织变干、皱缩，表皮龟裂、变薄。内部组织逐渐变黑，通常有真菌、细菌、蜻类等其他生物的次生侵染，该线虫则在病组织和健康组织交界处聚集。有病的块茎在贮藏期皱缩，表现干腐症状。危害甘薯块茎的症状与危害马铃薯块根的症状相似。被侵染的大丽菊球茎亦表现相似的症状。莺尾和郁金香受侵染通常从基部开始，渐渐向上扩展至肉质的鳞茎，导致灰白色至黑色的病变F严重时根系变黑，叶片发育差，叶尖成黄色。A.4 生物学腐烂茎线虫的发育和繁殖温度为5c - 34 c ，最适温度为20.C-27 .C，在20c - 24 c条件下完成生活史需要20d-26 d。该线虫仅可在土壤中作短距离移动，不能远距离自然传播，灌溉水也
23、可携带线虫在田间传播。主要随被污染了的植物材料及其他寄主植物的种子、植物组织和地下器官(球茎、鳞茎、根茎等)作远距离的传播、扩散，受该线虫污染了的土壤是另一传播途径。8 GB/T 29577-2013 附录B(资料性附录)腐烂茎结虫分离方法改进型漏斗法分离腐烂茎线虫，融合了浅盘法和传统漏斗法各自的优点，在提高漏斗法分离效率的同时，又解决了浅盘法一定要使用套筛而使植物组织等杂物经常堵塞400目筛的筛孔的问题。改进型漏斗法分离装置，由一只较大并类似于贝曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘装置相似(见图B.l)。将线虫滤纸或12层卫生纸平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分z将
24、待分离线虫的样品放置其上F从筛盘下部的空隙中将水注入分离器中，以淹没供分离的材料为lf:.;在约15c 25 c下放置24h48 h后，打开止水夹，用离心管接取约5mL的水样z静置20n:tin左右或1500 r/min离心3 min.吸去离心管内上层清攘后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。国B.1 改进型漏斗法分离钱虫装置示意图9 GB/T 29577-2013 附录C(规范性附录)双重PCR分子生物学检测流程C.1 DNA提取C. 1. 1 洗涤钱虫用线虫挑针挑取腐烂茎线虫若干条，放入去离子水中洗涤3次，备用。C. 1.2 切割结虫在洁净的载玻片上加20L去离子水，挑入10条经过洗涤的线虫，
25、用解剖刀将每条线虫切成34段，用移液器将含有切开虫体的去离子水10L转移至灭过菌的200L的离心管中。C. 1.3 DNA提取在上述管中加入8LWLB和2L蛋白酶K溶液，于一20.C冷冻30min以上，转入PCR仪.65c条件下保温1h2 h.95 .C条件下保温10min.使蛋白酶失活。取出后于13000r/min离心1min.取其上清液用于PCR扩增或者于一20c保存备用。C.2 PCR栓测C. 2.1 引物C.2. 1. 1 通用引物rDNA1:5人TTGATT ACGTCCCTGCCCTTT-3气rDNA2:5人TTTCACTCGCCGTTACT AAGG-3。C.2. 1. 2 特异
26、性引物DdS1:5人TCGTAGA TCGA TGAAGAACGC-3 ; DdS2:5-ATTATCTCGAGTGGGAGCGC-3 ; DdL1 : 5 -TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT -3 ; DdL2，5人GAGTGAGAGCGATGTCAACATTG-3。C. 2. 1. 3 内标D3A: 5 -GACCCGTCTTGAAACACGGA-3勺D3B:5人TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3 C. 2. 2 rDNA-ITS区的PCR扩增选取通用引物rDNA1和rDNA2.用来PCR扩增腐烂茎线虫rDNA中的5.8S，ITS1和ITS2全序列以及18S、28S部
27、分序列。反应体系:5L10XPCR缓冲液(含Mg2+离子).4L dNTP.2条引物各1.5L(20mol/L).2U Taq酶以及5LDNA粗提上清液，最后加去离子水补足50L.GB/T 29577-2013 PCR扩增条件:95c预变性4min;94 c变性455，50c退火305, 72 c延伸2min，共35个循环;72 .C保温10min;于4.C保存。C. 2. 3 电泳取5L扩增产物，加1L6X载样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，然后用凝胶成像仪观察。C.2.4 测序选用DNA凝肢回收试剂盒进行回收纯化PCR扩增产物，将其连接到pGEM-Tea5y，转化到大肠杆菌DH5a感受态
28、细胞F用质粒提取试剂盒提取重组质粒后，经EcoR1酶切和PCR检测后，进行双向测序。C.3 特异性引物双重PCR扩增栓测C. 3.1 A型特异性引物的检测C.3. 1. 1 A型特异性引物PCR扩增反应体系z取灭菌的离心管，依次加入25L10XPCR缓冲液(含Mg2-t-离子)，2LdNTP，引物DdS1、DdS2各o.7L( 20 rmol/L ) ,1 U Taq酶以及3LDNA粗提上清液作模板，最后加去离子水补足25L，设阴性对照。PCR反应条件:94.C预变性2min;94 .C变性305，55c退火305, 72 c延伸455，共35个循环572 c保温8miu，于4C保存。电泳检查
29、z取5L扩增产物，加1L6X载样缓冲液在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，然后用凝胶成像仪观察。C. 3.1.2 A型特异性引物双重PCR扩增反应体系z取灭菌的Eppendorf管，依次加入25L10XPCR缓冲液(含Mg2+离子)，2LdNTP , 引物D3A、D3B、DdS1、DdS2(浓度均为20mol/L)各0.5L，lUTaq酶以及3fLL DNA粗提上清液，最后加去离子水补足25Lt扩增程序及电旅检查同C.3.10C.3.2 B型特异性引物的检测分别作B型特异性引物的PCR扩增、双重PCR扩增，方法步骤同C.3.1，将引物DdS1和DdS2换成DdLl和DdL2即可。11 GB/T 295
30、77-2013 附录D(资料性附录腐烂茎钱虫形态特征腐烂茎线虫形态特征见图D.l、图D.2oB 时也乡坦坦坦马说明sA一一雄虫整体FB一一雄虫头部zC一一雄虫交合剌FD一一雌虫整体FE 雌虫头部zF一一雌虫体中部侧区;G一一-雌虫侧区横切面。注z该图引自Hooper，1973. 圄D.1腐烂茎结虫形态特征固12 说明=b / 今、 / 4、f_-一-A 帽一A 一一雌虫虫体前端EB 一一雄虫虫体前端zC，D，E一一雌虫虫体后部zF 一一雌虫卵巢前部FG 一雄虫尾部侧面观;H ,l 雄虫交合伞和交合刺zJ 一一批K 一一雌虫食道腺zL 雌虫卵巢前部。注g该图引自张绍升等，2006.二f , F
31、?吭吃句r B G E D 气包黯/ V 圄D.2倍率1000X的显微镜下的腐烂茎线虫形态结构圄GB/T 29577-2013 云如最13 28-hhmmNH阁。国华人民共和国家标准腐烂茎结虫栓噩鉴定方法GB/T 29577-2013 中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数24千字2013年10月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年10月第一版铃书号，155066 1-47521定价21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 29577-2013 打印日期:2013年11月8日F002
