GB T 29577-2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 16 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 29577-2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法Detection and identification of Ditylenchus destructor Tborne 2013-07-19发布2013-12-06实施fT费17事中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局也士料J中国国家标准化管理委员会。叩GB/T 29577-2013 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国
2、深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人z江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣、赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇。I GB/T 29577-2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法1 范围本标准规定了腐烂茎线虫CDitylenchusdestructor Thorne)的检疫鉴定方法。本标准适用于蔬菜和花卉的块茎、鳞茎、球茎等根茎部分,其他寄主植物种子、茎、叶及栽培介质中腐烂茎线虫的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1141-2002 鳞球茎
3、茎线虫检疫鉴定方法SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程SN/T 1158 进出境植物盆景检疫规程SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 腐烂茎钱虫基本信息中文名z腐烂茎线虫z马铃薯腐烂茎线虫。英文名:potatorot nematode;tuber rot nematode o 学名:Ditylenchus destructor Thorne, 1945 0 腐烂茎线虫隶属于线虫门NematodaCRudolphi , 1808) Lankester, 1877 ,侧尾腺纲Secernenteavon Linstow, 1905、垫刃目TylenchidaThorne, 19
4、49、粒线虫科AnguinidaeNicoll , 1935 (1926),茎线虫属Ditylenchus Filipjev,1936。腐足茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及栽培介质进行远距离传播。腐烂茎线虫的其他信息参见附录A。4 方法原理采集疑似寄主植物材料进行线虫分离,用显微镜观察分离到的线虫,依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫的形态学特征进行形态学鉴定,双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段。5 仪器用具5. 1 仪器生物显微镜(100X1 OOOX)、体视显微镜(10X80X,具透射光源、冰箱、电热恒温箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机(1000 r/
5、min5 000 r/min)、纯水仪。5.2 用具改进型漏斗分离器、移液器(10L、25L、100L、1000L);其他用具参见SN/T1141-2002中GB/T 29577-2013 的第3章所列的用具。6 试剂6. 1 形态学鉴定用试剂参见SN/T1141-2002中的第4章所列试剂。6.2 分子栓测试剂WLB (500 mmol/L氯化饵、10mmol/L T丘吉盐酸、pH8.0、15mmol/L氯化镜、1.0 mmol/L DTT、4.5%吐温20)、蛋白酶K(6mg/mL)、10XPCR缓冲液(20c保存、25mmol/L氧化钙溶液(-20c保存)、dNTP(10 rnmol/L
6、)、T吨酶(5U/L,-20 .C保存)、6X载样缓冲液、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、澳盼蓝载样缓冲液(6XTAE缓冲液,60%甘袖,0.3%澳酣蓝;4 c保存、澳化乙键(EB,避光保存、DNAladder marker( - 20 c保存、DNA凝胶回收试剂盒(室温保存)、EcoR1酶(-20 c保存)、大肠杆菌DH5a感受态细胞(一70.C保存)、质粒提取试剂盒(室温保存)。7 现场检测7. 1 检查对植物进行检查,注意植物地上部分是否有生长不良,叶色失绿、黄化,植株矮化等症状s块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤,做好记录,
7、写上标签,带回实验室检验。7.2 抽样应有针对性地抽取具有可疑症状的样品,分别用塑料袋装好,加贴标识;带回实验室后,打开袋口透气,适当保温,放在20C25 oC室内待检。对于元可疑症状的样品则按要求随机抽样,具体抽样比例按照SN/T1157、SN/T1158和SN/T2122 中的规定进行抽样。8 实验室检验8. 1 线虫分离采用两种方法进行分离:洗盘分离法按照SN/T1141-2002中B.2中对对线虫分离的要求进行,改进型漏斗法参见附录Bo8.2 标本制作见SN/T1141-2002中的附录Co8.3 显微观察、描述和测计在显微镜下,对线虫进行形态观察、描述和测计。8.4 分子生物学检测对
8、形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测(见附录C)。2 GB/T 29577-2013 9 形态学鉴定9. 1 茎钱虫属形态鉴定特征9. 1. 1 总则茎线虫属的雌虫和雄虫,其尾形非常相似,呈长圆锥形到近柱形,偶尔丝状,多数c(尾长胆门或泄殖腔处体宽)为47,寄主不形成虫瘦。9. 1. 2 雌虫9. 1. 2. 1 体表特征虫体一般较纤细,略弯曲,长O.6 mm1. 5 mm,表皮有很细的环纹,侧区有46条侧线。9. 1.2.2 内部特征口针细小,多数长度为7ml1m;中食道球有或元瓣,偶尔元明显的中食道球,峡部与后食道腺之间无缝缩,后食道腺短或长,不覆盖、短覆盖或长覆盖肠。9.
9、1.2.3 生殖系统特征雌虫单生殖腺、前伸,卵巢短或长,有时伸达食道区或转折,卵母细胞一行至两行排列,子宫柱状部有四排细胞(每排四个细胞)。有后阴子宫囊,且与虫体中线垂直。9. 1. 3 雄虫雄虫体表特征和消化系统特征与雄虫相似。雄虫精巢不转折,精细胞大(通常直径3m5m),交合伞延伸至尾长的1/43/4处,从不伸达尾顶端。交合刺窄细,基部宽大,其上具特殊的突起。9.2 腐烂茎钱虫形态鉴定特征9.2. 1 雌虫9.2. 1. 1 体表特征温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲,有细微的环纹,体宽约1m,!lJ线六条,在虫体两端渐减为两条:唇区低平,略缝缩,唇区框架进行程度较高,侧器孔位于侧唇片。
10、9.2. 1.2 内部特征口针长度常约为10m14m,针锥常占口针长度的45%50%;口针基部球清晰、圆形,前表面向后斜。中食道球纺锤形,肌肉发达,有瓣,食道狭部窄,神经环包围处开始膨大为棒状的食道腺体E食道腺延伸、从背面稍覆盖肠的前端一小段偶尔维缩h偶然亦能见到后食道腺分枝(叉)。排泄孔位于食道腺位置;半月体刚好在排泄孔前方。3 GB/T 29577-2013 9.2. 1. 3 生殖系统特征阴门清晰、横裂,位于虫体后部,成熟雌虫的阴唇略隆起,阴门裂与体轴线垂直,阴门宽度占4个体环。卵巢发达、前伸、达食道腺基部,前端卵原细胞双行排列。卵长椭圆形,长度约为体宽1.5倍。后阴子宫囊大,延伸至虹阴
11、距2/34/50直肠和脏门明显,尾长约为虹门部体宽的3倍5倍。尾锥形,稍向腹部弯曲,末端窄圆。9.2.2 雄虫虫体比雌虫短而细,前部形态与雌虫相似,经热杀死后体直或向腹面弯曲成弓形。尾比雌虫的尾部略牢,且末端尖圆F单精巢前伸,前端可达食道腺基部。泄殖腔隆起,交合伞起始于交合刺前端水平处,向后延伸达尾长3/4;交合剌戚对,长24m27m,向腥面弯曲,前端盘苦大具指状突;I带短、简单。9.3 腐烂茎结虫形态特怔圄参见附录D。9.4 测计值表1列出了腐烂茎线虫雌虫和雄虫形态测计值q表1腐提茎结虫形态测计值L St N 数据来源a b C V T 口1mm 条Thorne 雄虫0.81-1. 40 3
12、035 8-10 li-20 78-83 (1945) 雄虫0.80-1.30 34-40 78 12-16 Goody 雌虫0.69-1.89 |1949 4-12 9-30 73-90 237 一-一一(1952) 雄虫0.76-1. 35 24-50 4-11 11-21 40-34 231 Brzesk 雄虫O. 691. 89 18-49 4-12 14-20 77-84 10-13 (1991) 雄虫0, 63-1. 35 24-50 4-11 11-21 10-12 / 注zN一一测计的线虫样本数目zL 虫体体长(单位为m或mm,头端至尾端的长度,不包括尾尖突); St 口针长度
13、单位为m); a一一体长/最大体宽zb -一体长/.!体前端至食道腺与揭连接处的距离;c一一体长/尾t幻T一一泄殖腔开口至精巢末端的距离XI00/体长;V一一虫体前端至阴门的距离X100/体*.9.5 腐炬茎钱虫与两种近似种的区别表2列出了腐烂茎线虫与其他两种常见的茎线虫的形态区别对照。4 GB/T 29577-2013 表2茎结虫属三种常见钱虫的主要形态区别对照表种别项目腐烂茎线虫鳞球茎茎线虫蘑菇茎线虫Ditylenchus destructo D.disacl D. myceliohagus 侵染部位主要是地下部分,偶见地上部分地上和地下部分蘑菇菌丝寄生专化性高等植物和真菌专性寄生高等植物
14、真菌是否产生线虫毛不产生产生不产生侧线数目6 4 6 食道与肠覆盖程度覆盖不瞿盖覆盖交合刺有元指状突起有无不详尾部末端形状钝尖锐尖钝尖卵原细胞排列情况双行或多行单行单行卵的平均长度与虫体宽相近虫体宽的2倍-3倍约虫体宽的2倍后阴子宫理与JJI阴距比2/3 1/2 1/2 中食道球形状纺锤形纺锤形纺锤形10 结果判定符合9.2中描述的形态特征的线虫,可鉴定为腐烂茎线虫F或者符合第9章形态特征的疑似线虫,经8.4中的分子生物学检测,采用通用引物扩增获得的PCR产物分别约为940bp( A型腐烂茎线虫)和1100 bp( B型腐烂茎线虫),经特异性引物扩增的特异性片段约为252bp( A型腐烂茎线虫
15、和485 bp( B型腐烂茎线虫),阴性对照元产物时,也可判定检测的线虫是腐烂茎线虫。11 样晶保存11. 1 植物材料保存对已经检出带有腐烂茎线虫的植物材料、土壤或栽培介质等,经登记后,要保存在低温干燥、防鼠防虫处,并注明样品编号、截获日期、截获地点、截获人、寄主名称、运输工具名称、来源国等,样品需至少保存一年,有特殊要求可适当延长保存期。11.2 线虫标本保存11. 2. 1 钱虫样本的保存如果鉴定为腐烂茎线虫,经线虫固定液固定后置于有4%甲醒溶液的指形管内,在4(:冰箱内长期保存,并标上样品编号、制作时间和制作人等相关信息。5 GB/T 29577-2013 11. 2. 2 玻片标本和
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