1、望ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 29578一2013甘震白色条纹病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas albilineans (Asbby)Dowson 2013-12-06实施2013-07-19发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检菠总局中国国家标准化管理委员会也1lt1.，。-)飞、电二、t/， 呛时，4J陆茸茸饰，/前本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国天津出人境检
2、验检疫局、重庆大学。本标准主要起草人z刘鹏、刘跃庭、崔铁军、王中康、廖芳、张裕君、冯洁、黄国明，GB/T 29578-2013 I GB/T 29578-2013 甘藤白色条纹病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了甘藤白色条纹病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于甘蔚廉苗、茎轩等植物材料中甘庶白色条纹病的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T 1193 基因检验实验室技术要求SN/T
3、 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 甘蔚白色条纹病菌基本信息中文名z甘蔚白色条纹病菌。学名:Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson. 病害英文名:sugarcane leaf scald disease. 属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria ，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas.主要靠感病株和机械传播s被感染的种蔚是该病传播的主要方式，削刀(包括装载机械化切刀)也是一个重要的传播源。夹
4、风雨、啃齿动物以及甲虫、煌虫、叶蝉和甘蔚螺虫等害虫也是甘藤白色条纹病的传播途径。甘藤白色条纹病菌的其他基本信息参见附录A.4 方法原理依据甘藤白色条纹病菌在寄主植物上造成的病害症状特征，以及该病原菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检测鉴定。5 仪器用具电子天平感量0.0001 g)、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜、高速冷冻离心机(12000 r/min)、掌上离心机、纯水仪、恒温水浴锅、BIOLOG细菌自动鉴定系统、细菌微量生化鉴定管、低温冰箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、真空冷冻干燥机、培养皿(直径90mm)、可调式微量进样器(1
5、0L、100L、200L、1000L、研钵、离心管(1.5 mL)、PCR管(0.2L)、一次性注射器(2mL)等。1 GB/T 29578-2013 6 试剂和培养基6. 1 试剂酵母膏、蛋白脏、蔚糖、硫酸镜CMgS04 7H20)、磷酸氢二饵CK2HP04)琼脂精、氯化娱CMgClz)、dNTPsCdATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Taq Polymerase、乙二胶四乙酸CEDTA)、三起甲基氨基甲皖CTris)、盐酸CHCD、冰乙酸CC2H402)、澳化乙键CC21H20N3Br)、琼脂糖、DNAMarker等。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为灭菌双蒸水。6.
6、2 培养基YSP培养基、523培养基:f配制方法见附录Bo7 栓擅鉴定方法及步骤7. 1 现场栓疲甘藤种植园的病害调查或进出境甘煎样品的现场检疫中，若发现甘蔚植物叶片出现与叶脉平行的白色细长条纹，有的白色组织中有很小的红褐色斑点或很浅的红线，或出现红色坏死菇纹，有的严重的植株叶片呈现白色枯萎症状(详见附录A中描述)，应取甘煎基部茎轩(地上部分)2节4节带回实验室做进一步分离鉴定。在进出境检疫中，对于没有症状的甘肃样品，同样取茎基部部分，取样方法和步骤参照SN/T2122。7.2 病原菌分离将甘蔚茎轩表面清洗后，用75%酒精擦拭消毒。用灭菌的刀具横切茎轩，观察横断面是否有菌服渗出。若没有发现菌肤
7、，则用灭菌手术刀切取茎秤内部组织小块若干，放入灭菌的研钵中将组织液研出，吸取1mL组织被加人1.5 mL离心管中，8000 r/min离心10min，弃去上清掖后将沉淀用1mL 元菌水稀释，该稀释被1mL再进行系列浓度的稀释，稀释倍数分别为10倍，100倍，1000倍，10000倍，100000倍取5个PCR.管，分别加入0.9mL元菌水，从稀释液开始，浓度曲高到低依次加人0.1mL元菌水)。将每个浓度的稀释液在YSP培养基平板(直径90mm)上进行涂布，20L/平板，每个浓度做3个平板。若发现茎轩断面有渗出的菌服，可直接用接种环蘸取并在YSP培养基平板上划线分离。每份样品做不少于3个平板即可
8、。将涂布或划线分离的YSP培养基平板置于30c恒温培养箱中进行培养，7.3 培养筛选经涂布或划线分离的YSP培养基平板在30c条件下培养48h72 h后观察是否有直径达到1mm 左右、黄色或浅黄色、光亮、平滑、圆整的可疑菌落产生。挑取可疑单菌落进行分离纯化，之后再转接2次进行纯化。对纯化的可疑菌落进行7.57. 7步骤的检测。若未发现可疑菌落则判定该样品检验结果为未检出甘藤白色条纹病菌。7.4 革兰民染色检测方法和步骤参照GB/T4789.28。2 GB/T 29578-2013 7.5 生化指标测定应用细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行以下12项生化指标的检测z果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、
9、山梨醇、木糖、木糖酶、纤维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐。或应用BIOLOG细菌自动鉴定系统进行鉴定。7.6 分子生物学测定分子生物学检测中安全措施方面的要求参照SN/T1193。分子生物学测定的具体试验方法和试剂配制见附录B.采用特异性引物XAF1/XAR1对可疑菌株进行PCR检测，用甘藤白色条纹病菌标准菌株作阳性对照，用黄单胞属非甘蔚白色条纹病菌的植物病原细菌作阴性对照，用水作空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段大小为600bp的单带，且阴性对照和空白对照未有扩增条带的前提下，可疑菌株扩增结果与阳性对照一致，可判定分子生物学检测结果为阳性。7.7 致病性
10、测定用甘蔚感病品种(新台糖16号、粤糖町等)植株进行致病性测定，接种方法采用注射接种方法，试验设置阴性(元菌生理盐水接种)和阳性对照。温度为白天32.C，晚间26C;光照12h，相对湿度为70%。应用温室中培养的1月龄庶苗，取在523培养基上培养24h的菌株，用无菌生理盐水配制细菌悬浮液(108CFU/mL)，用注射器将菌悬液注入蔚苗茎轩基部约0.5mL接种5d.7 d后观察症状，顶端叶片是否有白色条纹或叶片的自化枯萎症状是否出现。8 结果判定分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下五个方面的检测结果，则可以判定检出甘蔚白色条纹病菌。a) 在YSP培养基上的菌落特征与7.3中描述相符。b) 革兰氏染
11、色结果为阴性杆菌。c) 生化指标测定中，果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、山梨障、木糖检测结果为阳性。木糖酶、纤维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐检测结果为阴性。或经BIOLOG细菌自动鉴定系统检测判定为甘藤白色条纹病菌.d) 分子生物学检测结果为阳性。e) 致病性检测表现典型症状。9 样晶保存检出甘藤白色条纹病菌的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁F保存期满后，需经灭菌后方可处理。10 菌种保存分离并最终鉴定为甘蔚白色条纹病菌的菌株应转接到523试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4C低温冰箱中保存，30d60 d转接一次，以防止病菌死亡，以备复核、谈判和仲裁。必要时将菌株用真空冷冻
12、干燥机冻干后长期保存。3 GB/T 29578-2013 附录A(资料性附录甘露白色条皱病菌的其他信息A.1 分布贝宁、布基纳法索、喀麦隆、加纳、青尼亚、象牙海岸、马达加斯加、马拉维、毛里求斯、摩洛哥、莫桑比克、多米尼加、尼日利亚、留尼汪、南非、斯威尔兰、多宁、坦桑尼亚、刚果、津巴布韦、扎伊尔、缅甸、柬埔寨、印度、印度尼西亚、日本、巴基斯坦、菲律宾、伊拉克、斯里兰卡、泰国、越南、澳大利亚、斐济、夏威夷、墨西哥、美国、巴巴多斯、古巴、格林纳达、瓜德罗普、危地马拉、牙买加、马提尼克、巴拿马、波多黎各、圣基茨、圣卢西亚、圣文森特、特立尼达和多巴哥、阿根廷、巴西、乌拉圭、圭亚那、苏里南、巴拉圭、委内瑞
13、拉、中国(台湾、江西、广东、福建)。A.2 寄主范围甘藤(Sacchaeruofficinarum)、玉米(Zeamays)、象草(Pennisetum归ureum)等。A.3 危害甘蕉白色条纹病也称甘蘸叶灼病，属系统性病害，由于庶茎维管束被病菌粘液淤塞，影响水分运输，致使甘蘸叶片的条纹坏死，在干旱季节会发生整株的突然枯萎死亡。该病害常为潜伏侵染，细菌获得机会活跃时，才呈现外表病征，有慢性型和急性型，潜伏期不表现症状。急性型症状z典型特征是茎杆突然萎缩枯死，而不表现其他的任何症状。有时从茎杆基部或节间侧生叶片具有典型的细长条斑的边辅。慢性型症状z病初叶片出现1mm2 mm宽的与叶脉平行的白色细
14、长条纹，其数目、长度不一，或细小，或整片叶变白，变白程度亦不尽相同，有的白中略带哉黄，有些在白色组织中有很小的红揭色斑点或很浅的红线，后期部分条纹变成红色坏死。条纹常常沿中脉背面延伸或扩展至叶辅周围呈现紫色色调，蔚株生长点受抑制，易抽侧芽。此外，慢性期的症状还包括尖端焦枯内卷成直立的枯辅，叶缘部分或全部坏死，并丛生出典型叶片症状的再生蔚苗。白条病诱发的褪绿症状和白化苗容易混淆影响诊断。然而白条病往往部分变色，存在红色坏死点，症状交界处不规则、波纹状，部分褪绿区域常常位于叶片中段。白化症常常在栽植3月6月后叶片呈现白化。A.4 生物学特性甘藤白色条纹病(sugarcaneleaf scald d
15、isease)是甘蔚上重要的检疫性细菌病害，主要危害甘庶的维管束组织，属系统性病害，由于藤茎维管束被病菌粘液淤塞，影响水分运输，致使甘藤叶片的条纹坏死，严重时可造成整株枯萎死亡。干旱、水浸和低温等环境因素能提高该病严重度。菌体杆状，(0.3 0.4)mX (0. 81. 4)m;单生或成链，极生单鞭毛，革兰氏染色阴性，最适生长温度为25C，最高为35 c。在营养琼脂上不能生长z在2%蔚糖、1%蛋白陈琼脂或类似的培养基上生长缓慢，YSP琼脂上3 d出现菌落。菌落黄色或浅黄色，光亮，平滑，圆整E过氧化氢酶阳性，精氨酸水解酶阳性，vp试验阳性，磷酸盐还原反应阴性s只能在氯化铺浓度低于0.5%的培养基
16、中生长，生长需要谷氨酸和维生素Bl4 GB/T 29578-2013 不水解明胶、淀粉和蛋白酶，不产生呵|牒，不产生硫化氢;可以利用果糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、菊粉、乳糖、甘露糖、蜜二糖、蜜三糖、山梨糖)醋、庶糖、木糖z不能利用木糖蹲、纤维二糖、麦芽糖、甲基葡萄糖戒、甘露醇、鼠李糖、水杨昔、酒石酸盐和安息香酸盐。对新生霉素、青霉素G、甲氧苯青霉素及多粘菌素相对不敏感。5 GB/T 29578-2013 附录B(规范性附录)培养基配制和PCR检测方法B.1 培养基配制B. 1. 1 YSP培养基酵母膏5g，蛋白陈10g，庶糖20g，琼脂粉15g，蒸锢水1000 mL. 121 c湿热
17、灭菌20min. B. 1. 2 523培养基蛋白陈8g，酵母膏4g，硫酸镜CMgS04 7H20)0. 3 g，蔚糖10g，磷酸氢二饵CK2HP04)2 g，琼脂粉18g，蒸锢水1000 mL.调整pH值至7.0-7.1，121c湿热灭菌20min。B.2 试剂配制B. 2.1 TAE电泳缓冲液C50X储存液，pH值约8.5)242 g Tris碱，57.1mL冰乙酸，37.5g Na2EDTA. 2H20，加水至1L. B.2.2 TE缓冲撞10 mmol!L Tris. Cl ,pH8. 0;1 mmol!L EDTA,pH8. 0。B.3 PCR反应模板制备可直接用培养的菌株稀释成菌悬
18、液C107CFU/mL)作为PCR反应模板E也可按精编分子生物学实验指南中的方法提取细菌基因组DNA，提取后可用TE缓冲液溶解，-20c保存。B.4 定性PCR检测B. 4.1 PCR栓测引物序列XAF1:5人CCTGGTGATGACGTGGGTT-3XARl:5人CGATCAGCGATGCACGCAGT-3 扩增产物600bp) B.4.2 PCR反应体系(30L)10XPCR缓冲液3L dNTP(2. 5 mmol!L) 1.2L 引物Pl(10 mmol!L) 1L 引物P2(10mmol/L) 1L TaqC5 U/L) 0.2L 双蒸水22.6L 6 GB/T 29578-2013
19、DNA模板1L B.4.3 PCR反应程序94 C /3 min;94 C /30 s;58 C /30 s;72 C /40 s;38次循环;72 C /5 min;4 .C保存。B.4.4 PCR扩增产物的检测1%1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行分析并拍照，记录试验结果。EON-hmNH阁。华人民共和国家标准甘藤白色条搜捕菌栓在鉴定方法GB/T 29578-2013 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里凋北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数16千字2013年9月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年9月第一版* 书号:155066.1-47513定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107打印日期:2013年9月26日F002
