1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 29581-2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv. betUcola (Patel et a1. ) Vauterin et aI. 2013-07-19发布2013-12-06实施.&._lJIng，.l_ r !川、，飞习、/吧。愿与t卢晤何;句句t证正在理，吵屉董蜘/中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局也士中国国家标准化管理委员会c(.IJ 前本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。_._ = E
2、司本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。GB/T 29581-2013 本标准起草单位z中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人z刘福秀、冯黎霞、龙海、李伟东、凌杏园、韩玉春、周先超。I GB/T 29581-2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了胡椒叶斑病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola)的检疫和鉴定方法。本标准适用于植物苗木等繁殖材料及组织中胡椒叶斑病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的
3、。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28-2003食品E生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 胡椒叶斑病菌基本信息中文名z胡椒叶斑病菌(胡椒细菌性叶斑病菌z地毯草黄单胞杆菌萎叶致病变种)。学名:Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola (Patel, Kulkarni &. Dhande 1951) Vauterin, Hoste, Kersters &. Swings 1995. 异名:Xanthomonas camestris pv.betlicola (Pa
4、tel, Kulkarni &. Dhande 195 1) Dye 1978. 病害英文名:bacterial leaf spot of pepper、pepperbacterial leaf spot。属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、y-变形细菌纲Gammaproteobacteria、黄单胞菌目Xanthomonadales、黄单胞菌科Xanthomonadaceae、黄单胞菌属Xanthomonas、地毯草黄单胞杆菌Xanthomonasaxonopodis. 胡椒叶斑病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理根据胡椒叶斑病菌的寄主范围、培养性状
5、、生理生化特性和所致病害的症状特点，采用病原菌的分离、病菌培养性状观察、生理生化特性检测以及致病性测定等方法进行检测和鉴定。5 试剂与培养基5.1 试剂无菌水、琼脂、酵母提取物、蛋白陈、葡萄糖、营养琼脂、牛肉膏、氧化锅、氢氧化铀。果糖、木糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露醋、海藻糖、甘油、水杨背、廉糖、山梨糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、草酸铀，-起基丁酸锅、就踊酸铀、苹果酸、乳酸铀、拧攘酸铺、酒石酸铀、DL-精氨酸明胶、石莓牛奶。5.2 培养基病菌分离采用NGA培养基(见附录酌，病菌增殖采用营养琼脂培养基见附录B)。1 GB/T 29581-2013 6 仪器和用具天平、搅拌器、冰箱(4c土2C; -
6、80 C)、无菌(新)塑料封口袋、脱脂棉、石棉铁丝网、高压灭菌锅、培养箱(29C士1C I或其他可以控制温度的暗室)、无菌昆虫针、紫外灯、小型离心机、酸度计或精密pH试纸、超净工作台等。7 检测与鉴定7.1 现场检瘟7. 1. 1 感冒检查仔细检查，观察典型症状或可疑症状(参见附录A)。感病组织表面可能有菌睐。7.1.2 样晶抽取发现可疑植株，切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验。7.2 室内检测与鉴定7.2.1 南原菌分离取小块病组织用元菌水冲洗后就人0.5mL2.0 mL无菌水中，观察是否有细菌溢出，如果有喷菌现象，则用接种环挑取喷出的菌液，在NGA培养基(参见附录B)上划线分离。如没有
7、喷菌现象，则用灭菌玻棒将病组织研碎，在室温下浸泡15min20 min.用接种环挑取组织液在NGA培养基上划线分离。看不到症状的情况下，用元菌水洗涤病组织病组织为叶片时，洗涤量应在10片以上).洗涤液离心浓缩后做适当稀释，在NGA培养基上划线分离。划线细菌在28.C 30 C下黑暗培养至少设2个重复。3d后即可观察所产生的菌落。如呆发现可疑的菌落应该及时使用NGA培养基进一步纯化培养观察，并进行后续试验。7.2.2 菌落形态观察配制表1所列9种培养基，并按表l所列培养条件培养待检菌株，其中1是必需的.29可选。表1胡椒时斑病菌在不同培养基上的培养性状序号培养基培养条件典型培养性状1 营养琼脂2
8、8 c -30 c下培养7d 菌落圆形，黄色，有光泽，全缘，稍隆起，粘稠牛肉膏陈培养液28 c - 30 c下振荡培培养液轻度浑浊，无液面生长，沉淀物不明显2 养24h或静止培养7d 菌落圆形，直径1mm-2 mm.表面光滑，闪光，边缘3 牛肉膏炼琼脂平面28 c -30 c下培养7d 完整，乳酷状，低度凸起，半透明或不透明，乳白带浅黄色酵母膏陈培养液28 c - 30 c下振荡培培养液轻度浑浊，无液面生长，沉淀物不明显4 养24h或静止培养7d 牛肉膏陈障母葡萄28 c - 30 c下振荡培培养液中度浑浊，液困生长环状，沉淀物少量5 养24h或静止培养7d 糖培养液2 GB/T 29581-
9、2013 表1(续序号培养基培养条件典型培养性状6 牛肉膏陈障母葡萄菌苔均为线状，快速生长，乳酸状，不粘稠，乳白带浅28 c - 30 c下培养7d糖琼脂斜面黄色，培养基不变色7 牛肉膏陈酵母葡萄菌落圆形，直径3mm-5 mm，表面光滑，闪光，边缘糖琼脂平板28 c -30 c下培养7d 完整，乳醋状，低度凸起，半透明或不透明，乳白带浅黄色8 牛肉酱陈琼脂斜面28 c -30 c下培养7d 菌苔均为线状，中度生长，乳酶状，不粘稠，乳白带浅黄色，培养基不变色9 酵母膏陈琼脂斜面28 c -30 c下培养7d 菌苔均为线状，中度生长，乳醋状，不粘稠，乳白带浅黄色，培养基不变色发现典型菌落的结果判为
10、阳性，同时记录可疑菌落数，并进行后续试验。如没有发现典型的菌落，结果判为阴性。7.2.3 草兰氏染色革兰民染色按GB/T4789.28-2003中2.2的规定进行试验。观察革兰氏染色反应的试验结果和菌体形态。胡椒叶斑病菌革兰民染色呈阴性反应。典型菌体短杆状，末端圆形，大小为(0.4m-0.7m)X0.0m-2.4m) ，单个或成双排列，有3-5个的短链。无芽抱，无英膜，有运动性，鞭毛为单根极生。革兰氏染色呈阴性反应，且观察到菌体典型形态的结果判为阳性，并进行后续试验。如革兰氏染色反应呈阳性，或革兰氏染色反应呈阴性但没有观察到菌体典型形态，结果判为阴性。7.2.4 生理生化特性测定将上述分离的等
11、检细菌用微量生化反应管进行生理生化特性测定。以X.axono户odispv.betlicola 阳性菌株做对照，每个测定项目设3个重复。生理生化特性测定结果与附录C结果一致判定为用性，并进行致病性测定。否则判为阴性。7.3 致病性测定7.3.1 针刺接种采用平板划线法在营养琼脂培养基平板上纯化刚分离的待测细菌，在28c - 30 c温度下培养2 d-4 d，移出单个菌落后进一步扩大繁殖。取待测细菌在营养琼脂培养基上培养24h-48 h，用灭菌的昆虫针蘸取菌落，在胡椒苗嫩叶背面进行剌伤接种(Pan-niyur系列品种或其他品种都行，国内主栽品种都感病)。每个菌株接种3片叶。接种标准的阳性菌株作为
12、阳性对照，同时接种非致病菌和无菌水作为阴性对照。接种后的植株置放于人工气候箱，在28c - 30 c温度下，先在100%相对湿度下保湿24 h-48 h，然后在80%左右的相对湿度下，每天在7000 lx-10 000 lx下光照培养16h，黑暗下培养8 h.接种5d-7 d后，观察是否出现水渍状角形病斑，每天观察一次，接种后30d不表现症状的视为不发病。试验重复3次。用喷雾法接种于胡椒或萎叶叶片上也能产能水渍状多角形病斑。3 GB/T 29581-2013 7.3.2 病菌再分离按7.2.1的方法对7.3.1中发病的植株进行病菌再分离，能得到7.2.2描述的纯培养判为阳性，否则判为阴性。8
13、结果评定没有发现典型的菌落，即菌落形态观察结果为阴性，判定为未检出胡椒叶斑病菌。革兰民染色呈阳性反应，即革兰氏染色结果为阴性，判定为未检出胡椒叶斑病菌。生理生化特性测定结果与附录C结果不一致，即生理生化特性测定结果为阴性，判定为未检出胡椒叶斑病菌。致病性测定试验中，接种后没有出现典型症状，或出现了典型症状但没有从接种后发病的组织中再分离到与原接种物相同的病原菌，即致病性测定结果为阴性，判定为未检出胡椒叶斑病菌。菌落形态观察结果、革兰氏染色结果、生理生化特性测定结果和致病性测定结果四者均为阳性，判定为检出胡椒叶斑病菌q9 样品和菌种保存9.1 样晶保存样品(包括健康和发病的植株或组织)拍照后均应
14、制成干标本，经登记和签字后置于4C冰箱或阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存甸对鉴定为胡椒叶斑病菌的样晶至少应保存6个月，以各复检、谈判和仲裁，样品保存期满后，需经灭菌处理。9.2 菌种保存从样品中分离并鉴定为胡椒叶斑病菌的新鲜菌种在营养琼脂培养基上28c -30 c培养24h后，用灭菌的昆虫针刮取细菌，放入装有无菌水的玻璃管中，封口后经登记和签字，置于室温或4C冰箱中保存z或用真空干燥机制成冻干粉置于一20c以下低温冰箱保存。对欲废弃的菌种应做灭菌处理。4 . GB/T 29581-2013 附录A(资料性附录胡椒叶斑病菌的其他信息A. 1 地理分布柬埔寨、马来西亚、印度、孟加拉国、新西兰、巴西aA
15、.2 寄主植物自然寄主z胡椒(PipTnigrum)、殷商(PiPersarmentosum)、海南南(PiPerhainanense)、萎叶(Pip旷betle)、假高粱(Sorghumhalepense)、拧攘(Citruslimonum)等。接种寄主:菜豆(Phaseolusvulgaris)等。A.3 症状特点胡椒叶斑病菌(Xanthomonasa;conopodis pv.betlicola)可侵染蔓、技、叶、花序及果穗，但主要侵害叶片。感病的叶片初为透明状的侵染点，随后扩大成多角形病斑，数天后，病斑中间呈褐色，外缘有黄晕，叶背病健交界处呈水渍状，雨天或湿度大时，常见有细菌溢服，成一
16、层明胶状薄膜。高温干旱期，病斑多在植株下层叶边缘和叶尖发生。蔓枝一般在节上或伤口感染，初为紫褐色，随后干枯脱节。花序及果穗一般先从璋的末端盛病，病部呈紫墨色、易脱落aA.4 传播方式该病菌主要通过伤口和自然孔口侵人寄主，侵染来源一是带病种苗，二是病株的残枝落叶，病菌在病组织中可存活1个月以上，三是野生杂草。病菌靠雨水、露水、风、昆虫及农事操作等近距离传播，带病的种苗和病残体可作远距离的传播，5 GB/T 29581-2013 B.1 淋病奈瑟菌培养基(NGA)附录B(规范性附录培养基的配制淋病奈瑟菌培养基的配方见表B.1.表B.1淋病奈瑟菌培养基的配方成分一酵母提取物蛋白陈葡萄糖琼脂蒸馆水配方
17、比例3.0 g 5.0 g 2.5 g 16.0 g 1.0 L 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胀、葡萄糖放人烧杯中。蛋白陈很易吸潮，在称取时动作要迅速。在烧杯中加入约800mL蒸锢水，用搅拌器搅拌，待药品完全溶解后，将称好的琼脂放人已溶解的药品溶液中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底。最后补足水分至1000 mL，再分装，103.43kPa (121 C)灭菌15min. B.2 营养琼脂培养基营养琼脂培养基的配方见表B.2.成分营养琼脂蒸馆水表B.2营养琼脂培养基的配方配方比例41 g 1000 mL 称取41g营养琼脂干燥粉末加入1000mL冷蒸馆
18、水中混合放置10min，隔石棉铁丝网微火煮沸使其完全榕解，分装，103.43kPa (121 C)灭菌15min。B.3 牛肉膏臆培养基牛肉膏陈培养基的配方见表B.3.6 GB/T 29581-2013 表B.3牛肉膏脏培养基的配方成分配方比例牛肉膏3.0 g 蛋白陈10.0 g 氯化纳5.0 g 琼脂(配制固体培养基时加入20.0 g 蒸馆水1000 mL pH值:7.0-7.2准确称取各种成分，一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中，向烧杯内加人所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去，加热搅拌全榕后稍放冷。用酸度计或精密pH试纸测定其
19、pH值，并用10%氢氧化铀溶液调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤，一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。分装，103.43kPa (121 C)灭菌15min。B.4 牛肉膏臆酵母葡萄糖培养基牛肉膏陈酵母葡萄糖培养基的配方见表BA。表B.4牛肉膏膝酵母葡萄糖培养基的配方成分配方比例牛肉膏1.5g 蛋白陈5.0 g 氯化铺3.5 g 磷酸氢二饵3.6)3 g 磷酸二氢锦1.32 g 琼脂(配制固体培养基时加入)20.0 g 蒸偏水1000 mL pH值:7.0-7.2配制方法同B.3.7 GB/T 29581-2013 附录C资料性附录)胡椒叶斑病生理生化特性C.1
20、生理生化特性胡椒叶斑病菌CXanthomonasaxonopodis pv.betlicola)耐盐度2%，初始生长pH值为5.68.5.可以在5.C37 c士1C生长，不能在41c士1.C生长。触酶反应呈阳性，氧化酶阴性。产氨，产硫化氢，不产呵|牒，水解淀糙，明胶液化，不还原硝酸盐，M.R.和V.P.反应阴性，石蓝牛奶产碱和陈化(详见表C.l)。表C.1胡椒叶斑病菌Cx.axonopodis pv.betlicola)生理生化特性初始生长pH值鉴别性生长温度液化硝酸耐盐氧化硫化淀粉石触酶氨喇嘛:现胶盐还M. R. V.P. 37 c土41 c士度/%酶氢水解牛奶最高最低5C 平板原1 C 1
21、 C 5.6 8.5 w + 2 + 十+ + + b.p. 注:b.表示产碱，p.表示陈化，+表示正反应，一表示负反应，W表示弱反应。C.2 碳、氨源利用情况该菌能利用珑甜酸盐、苹果酸、乳酸盐、拧撵酸盐作唯一碳源，并呈碱性反应。不能利用草酸盐、酒石酸盐、-是基丁酸盐和精氨酸作唯一碳摞(详见表C.2)。表C.2对有机酸和氨基酸作为唯一碳源的利用特性草酸销|户经基丁酸销| 我瑞酸销苹果酸乳酸锅拧稼酸销| 酒石酸销+ + + + 注:+表示生长，一表示不生长，C.3 碳水化合物发酵该菌葡萄糖氧化产酸不产气，果糖、木糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖和甘油产酸不产气。8 GB/T 29581-
22、2013 水杨背不产酸不产气，但能生长。藤糖、山梨糖、鼠李糖、棉子糖、肌蹲不产酸不产气(详见表C.3)。表C.3碳水化合物发酵特性9 的FON-mmNH阁。华人民共和国家标准胡椒叶斑病菌栓瘟鉴定方法GB/T 29581-2013 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号。00013)北京市西城区三里凋北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销每开本880X 1230 1/16 印张1字数18千字2013年10月第一版2013年10月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-47512定价GB/T 29581-2013 打印日期:2013年10月30日F002
