1、ICS 65.020.01 B 16 B 中华人民共和国国家标准GB/T 29582-2013 花生矮化病毒检疫鉴定方法Detection and identification of peanut stunt virus 2013国07国19发布2013-12-06实施JTLJh 中华人民共和国国家质量监督检验检蛮总局也t扭1中国国家标准化管理委员会.a.r. .L 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。GB/T 29582-2013 本标准起草单位z中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳
2、出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人z于翠、杨翠云、印丽挥、郑耘、廖富荣、郑建中、易建平。I GB/T 29582一2013花生矮化病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了花生矮化病毒检疫鉴定方法。本标准适用于活体植物材料，包括元性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中花生矮化病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 花生锺化病毒基本信
3、息中文名E花生矮化病毒。英文名:Peanutstunt virus. 异名:groundnut stunt virus; peanut stunt cucumovirus; robinia mosaic virus; clover blotch vlrus;peanut common mosalC Vlrus. 缩写:PSV。属雀麦花叶病毒科Bromoviridae，黄瓜花叶病毒属CucumoC.巾US.花生矮化病毒的其他信息参见附录A.4 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(doubleantibody sandwich enzyme-linked immunosorbe
4、nt assay，DA5-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)进行检测鉴定。5 仪器设备、设施、用具和试剂5. 1 仪器PCR仪、超净工作台、电子天平(0.001 g)、电泳仪、电泳槽、凝肢成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、-80c超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器。5.2 设施隔离温室(10C -30 C)。5.3 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L、5000L)及相应的元RNase吸头、
5、无RNase离心管、PCR管和研钵等。GB/T 29582-2013 5.4 试剂病毒检测试剂盒、Trizol、焦碳酸二乙醋CDEPC)、液氮、三氯甲皖、异戊醇、异丙障、乙醇、日-琉基乙障、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、漠化乙镜、琼脂糖、澳酣蓝等。血清学和分子生物学试剂配制参见附录B.注s除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。6 检测PSV的症状根据寄主植物和病毒株系的不同而变化，自然感染的植物症状是持久的。在花生(Arachis hypogaea Linn. )上有不同程度的矮化、节问缩短、叶片变小、轻斑驳、豆英畸形。在菜豆CPhaseolus vulga
6、ris Linn. )上，小三叶表现褪绿斑驳和花叶，而有些栽培种的小三叶变长，不能长成正常的叶片z烟草CNicotianatabccum nn.)，表面严重的斑驳，整株植物褪绿，或有褪绿斑井有橡树叶状的叶片F羽扇豆CLupinusmicrauthus Guss. )，叶片、花器畸形，植株矮化。当寄主植物表现症状时，可根据症状采样z当寄主植物元症状时，则可以按SN/T2122中规定的抽样方法进行。7 鉴定7. 1 鉴定流程有多种方法可对PSV进行检测鉴定。免疫电镜是一种快速方法，但是仅能对少量病毒含量高的样品进行检测，且需要透射电镜这样的贵重仪器。PT-PCR作为单一方法能够快速灵敏地进行检测，
7、但是需要实验室人员具备相当的专业技能.ELISA方法是一种快速、简单易学且需试验设备最少的方法，但是某些株系由于血清学关系远而可能被漏检。通常初筛时，根据样品量的多少选择ELISA或RT-PCR方法。具体操作流程可参照图1。鉴定样品是否带毒应两种或两种以上的方法相互验证。病毒寄主植物/样品固1PSV鉴定撞程图2 两种方法检测均为阴性. . GB/T 29582-2013 7.2 双抗体酶联免瘟眼附测定方法(DAS-ELISA)对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨，并按植物组织重量和抽提缓冲液1: 10的比例稀释，制备的计被分别盛装于离心管中，低速离心后吸取上清液待用于ELISA检测。具体
8、检测步骤见附录Co7.3 RT-PCR检测植株叶片或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNAoRT-PCR具体操作步骤见附录Do7.4 生物学检测在室温(20C25 C)条件下，栽种于检疫隔离温室中的昆诺事或克色馨、菜豆、普通烟、旺豆、番茄等鉴别寄主植物第一对真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种。对经DAS-ELISA或RT-PCR检测阳性的植株或种子，加入适量接种缓冲液研磨成汁液后接种指示植物。当任意一种指示植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功za) 克色毒草或昆诺毒草(Chenopdiumamaranticolor ,C. quinoa):接种叶出现褪绿斑，后系统叶出现褪绿斑和花叶
9、Fb) 菜豆(Phaseolusvulgaris Linn):褪绿或局部坏死斑，系统褪绿花叶或仅有花叶症状(不同栽培种上的症状也不同hc) 普通烟(N.tabacum) :接种叶上有直径5mm10 mm的线黄绿色环，系统感染的新叶上有褪绿区pd) 虹豆(Vignaunguiculata) :第一叶接种后的4d5d产生褪绿斑，2d3 d后小三叶表现脉明和向上束起ze) 番茄(Lycopersiconesculentum Linn):表现为类似感染黄瓜花叶病毒或番茄不孕病毒所引起的藏叶的叶片呈带状。7.5 免擅电镜检测按照SN/T1840中的方法进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到直径为
10、29nm的病毒球状粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。8 结果判定当DAS-ELISA结果阳性，且同时7.3、7.4或7.5中任一结果为阳性时，可判定样品携带有花生矮化病毒z当RT-PCR结果阳性，且同时7.2、7.4或7.5中任一结果为阳性时，也可判定样品携带有花生矮化病毒。9 样晶与记录结果保存9. 1 经检验确定携带花生矮化病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下，其他情况取试验样品保存在一20.C冰箱中，有条件的保存在一80c冰箱中更好。做好登记和标记工作。9.2 记录包括z样品来源、种类，取样人员，试验的时间、地点、方法和结果，检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法
11、检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析。3 GB/T 29582-2013 A.1 寄主范围附录A(资料性附录)花生矮化病毒其他信息PSV自然侵染大豆、花生、菜豆、刺槐、烟草、豌豆以及三叶草等多种豆科牧草。A.2 为富症状PSV影响寄主植物的整个生位期，典型症状为节间缩短、叶片变小、褪绿、畸形;在某种程度上，中期感染的症状与番茄斑萎病毒属引起的症状相似。早期感染的植株几乎不产生种子或种子不明显。PSV的症状根据主寄植物和病毒株系的不同而变化。自然感染的植物的症状是持久的。A.3 分布地区欧洲z法国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙
12、.亚洲z印度，日本，朝鲜半岛，中国的问北、山东、商南、江苏等省。非洲z摩洛哥、苏丹。美洲z美国。A.4 传播方式A.4.1 介体传播PSV可由蜻虫以非持久性方式传播。介体的获毒时间不到1min，传毒时间不到1min，元潜伏期，病毒不传给幼蜡。在试验条件下易摩擦接种。A.4.2 种子传毒可通过花生种子传给下一代植株，PSV从花生的种子传给幼苗的百分率低(大约0.1%)。大豆是否可种传该病毒，目前还元定论，有报道种传率可达3%-4%，也有报道不种传。尚元其他植物种子传播PSV的报道。A.4.3 其他传染谭在美国，病毒可在自三叶草、烟草、菜豆上越冬，这几种植物是感染源。A.5 粒体形态PSV粒体为等
13、轴对称二十面体，直径29nm. 4 . GB/T 29582-2013 A.6 基因组PSV基因组为三分体基因组，每个病毒粒子包裹有单分子的RNAj或RNA2或者RNA3和RNA40存在广泛的株系分化现象，根据分子遗传亲缘关系将PSV划分为三个亚组。5 GB/T 29582-2013 附录B(资料性附录)试剂配置B.1 10xPBST缓冲渡(pH7.4)氯化铀(NaCl)磷酸二氢饵(KH2P04)磷酸氢二铀(Na2HP04) 氯化饵(KCD80 g 2g 11. 5 g 2 g 吐温-20(Tween-20) 5 mL 溶于900mL的蒸馆水中，用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4，并定容至10
14、00 mL. B.2 样晶抽提缓冲液(pH7.4)亚硫酸铀(Na2S03)聚乙烯基毗咯皖酣(PVP)叠氮铀(NaN3)1. 3g 20 g 0.2 g 吐温-20(Tween-20) 20 mL 溶于900mL的1XPBST中，用浓盐酸(HCD调节pH至7.4，定容至1000 mL. B.3 包被抗体缓冲撞(pH9.6)碳酸铀(Na2C03)1. 59 g 碳酸氢铀(NaHC03)2. 93 g 榕解于900mL蒸锢水中，用浓盐酸(HCD调节pH至9.6，并定容至1000 mL. B.4 酶标抗体缓冲渡(pH7.4)1XPBST缓冲液牛血清白蛋白(BSA)PVP(相对分子质量24000-40
15、000) 用无菌蒸锢水定容至1000mL. 800 mL 2 g 20 g B.5底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)二乙醇胶97 mL 叠氮铀(NaN3)0.2 g 榕解于600mL的无菌蒸馆水中，用浓盐酸(HCD调节pH至9.8，然后用蒸锢水定容至1000mL. 6 B.6 反应终止擅氢氧化铀(NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸铺水中，浓度3mol/L. B.7 电泳缓冲液TAE(50X)三是甲基氨基甲烧(Tris)242 g 冰乙酸52.1 mL 乙二股四乙酸二铀(EDTA，0.5mol/L) 100 mL 用时加蒸榴水稀释至1XTAE.B.8 漠化Z键(EB)溶簸(10g/L)
16、澳化乙键灭菌去离子水20 mg 20 mL GB/T 29582-2013 7 GB/T 29582-2013 附录C(规范性附录)双抗体酶联免在眼附测定方法(DAS-ELISA)C.1 检测C. 1. 1 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。C.1.2 每孔加人100L的PSV的包被抗体溶液，封口膜包好.37c孵育2h4 h(或4C冰箱过夜。C. 1.3 将酶联板孔中溶液控干，用200L的1XPBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min.然后在干净毛巾或滤纸上扣干。C. 1.4 将100L制备的待测样
17、品溶液加入到设计的待检测孔中，对照孔中也各加入100L相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好.37.C孵育2h3 h(或4C冰箱过夜)。C. 1.5 洗涤，步骤同C.1. 3. C. 1. 6 用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体，每孔加入100L酶标抗体溶液，封口膜包好，并于37c孵育2h4 h。C. 1.7 洗涤，步骤同C.1.3。C. 1.8 将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为1mg/mL。每孔加入100L配好的底物溶液，室温孵育O.5 h2 h。必要时每孔加入50L的3mol/L氢氧化铀溶液终止反应。C. 1.9 酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.2
18、结果判定C.2.1 质量控制要求z缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15.阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按照式(C.l)进行计算zO)1 - OD2 1n/ p = ，_ l :-. ,_ X 100% (ODj + OD2) X 1/2 n ， u 式中zP 一一平行允许率FODj一一重复样品1的OD值FOD2一一重复样品2的OD值。当重复检测样品OD值平行允许率(p)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2 若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。C.2.3 在满足了C.2.1的质量
19、要求后，则按如下原则作出判定z样品OD.os/阴性对照OD405值明显大于2.结果判定为阳性z. ( C.1 ) 样品OD.os/阴性对照OD削值在阑值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证F样品OD峭/阴性对照OD.os值明显小于2，判为阴性。8 GB/T 29582-2013 D.1 植物总RNA提取附录D(规范性附录)RT-PCR检测方法D. 1. 1 取0.1g样品，液氮研细，加人1mL Trizol.混匀，倒入1.5mL离心管中。D. 1.2 加人0.2mL三氯甲烧，猛烈振荡15s .4C 11 000 r/min离心10min./J、心吸取上层元色水相到新离心管中。D
20、. 1. 3 加人等体积异丙醇，混匀，一20c静置10min.4 c 12000 r/min离心15min.保留沉淀。D. 1. 4 加入1mL 75%冷乙醇，悬浮沉淀.4(:8000 r/min离心10min.干燥沉淀。D. 1: 5 加人30LDEPC-H20.榕解沉淀(必要时.55C -60 c水浴10min.加速溶解).存于一80c 备用。注2或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作。D.2 51物序列正向引物PSV-IF:5 GCTCATGCT AGAGAGCTCCG3勺反向引物PSV-IR:5GAAGGGAT TCGCTGA TGCTC3 .扩增片断长度约550bp. D.3 反转录利
21、用提取的RNA在PCR管中进行反转录。首先加入3L模板RNA.lL下游引物(20mol/L) 8L水混合后70.C温育5min;立即置于冰上.2min后加入4LAMV缓冲液、1LdNTP (1 0 mmol/L)、1LAMV反转录酶(10U/L)、1LRNA晦抑制剂(40U/L).42c反应1h.也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。注z如不立即进行PCR扩增，应将逆转录产物置于一20c保存。D.4 核酸扩增PCR反应体系见表D.l.每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含花生矮化病毒材料的cDNA或含有花生矮化病
22、毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。表D.1RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/LPCR缓冲液X10 X1 2.5 dNTP 2.5 mmol/L 200 lmol/L 2 上游引物10mol/L 0.2mol/L 0.5 下游引物10mol/L 0.2mol/L 0.5 9 GB/T 29582-2013 表O.1 (续名称储存液浓度终浓度加样量/LTaq酶5 U/L 0.05 U/L 0.25 cDNA 1. 5 元菌水17.75 总体积25 0.4.1 PCR反应循环参数z普通PCR反应参数见表D.2.不同仪器可根据仪器要求将反
23、应参数作适当调整。表0.2普通RT-PCR反应参数变性扩增条件循环次数延伸94 C, 30 s 94 c 4 min 58 C, 30 s 30 72 C, 10 min 72 C, 45 s 0.4.2 PCR扩增产物的电琼捡副用电泳缓冲液(1XTAE)配制2.0%的琼脂糖凝胶(55c -60 c时加入漠化乙键至终浓度为0.5g/mL.也可在电泳后进行染色)。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9LPCR扩增产物，加1L10X上样缓冲液上样。恒压(5V/cm-6 V/cm)电泳40min-50 min.凝胶成像系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。0.5 结果判定如果阴性对照和空白
24、对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条带，则可判定样品为花生矮化病毒阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品出现预期大小条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与花生矮化病毒的序列同源，则可判定样品为花生矮化病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为花生矮化病毒阴性。也可通过荧光PCR的方式进一步确认。10 问FON|NmmNH阁。华人民共和国家标准花生矮化病毒栓瘟鉴定方法GB/T 29582-2013 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数22千字2013年10月第一版2013年10月第一次印刷 书号:155066. 1-47515定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 29582-2013 打印日期:2013年10月30日F002
