1、ICS 65.020.01 B 16 _.，;.:工-巳f;:.:.p;:;伽.飞，三、f:_ 依;.:古百万言画t:.古.烹节E二二t-;,_ r;，:主画画画_:I.-,;:._ -.:,:_ 1-一一一一一一、，-咀-正币.烈主运.1罩:.:.:注.，-国中华人民共和国国家标准GB/T 29585-2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法Detection and identification of Anguina agrostis (Steinbuch) Filipjev 2013-07-19发布2013-12-06实施.1雹阳，且FV飞j)/严、气E1、云祉-二甜何甜何甲响树瞄冉冉目 瞅噩
2、噩真切/ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准剪股颖粒结虫拴瘟鉴定方法GB/T 29585-2013 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。0004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数18千字2013年9月第一版2013年9月第一次印刷* 书号:155066. 1-47526定价16.00元如有印装差错由本社
3、发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 29585-2013 前本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人z王金成、杨秀丽、崔铁军、张治宇、刘鹏、廖芳、张裕君、牛春敬。I GB/T 29585-2013 剪股颖粒线虫检疲鉴定方法1 范围本标准规定了剪股颖粒线虫的检疫和鉴定方法。本标准适用于草籽及其他植物材料中剪股颖粒线虫的检疫及其鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是
4、必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 剪股颖粒缉虫基本信息中文名称z剪股颖粒线虫。英文名称:bentgrass nematode. 学名:Anguinaagrostis (Steinbuch,1799) Filipjev, 1936。分类地位z线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(TylenchidaThorne, 1949)、粒线虫科AnguinidaeNicoll , 1935 (1926汀、粒线虫属(AnguinaS
5、copoli, 1777)。带虫种子、虫瘦、植物病残组织是剪股颖粒线虫传播的主要载体。剪股颖粒线虫的其他信息参见附录A。4 方法原理现场检测获取样本，通过显微镜观察和分子生物学方法获取形态和核酸信息鉴定特征，进行鉴定。5 仪器、用具5. 1 仪器z显微镜(100X-1OOOX，具有目镜测微尺或绘图仪、图像捕获装置、测量软件、体视显微镜(lOX-80X，具透射光源)、冰箱、PCR仪、电泳仪、凝肢成像系统、低速离心机(1000 r/min-5 000 r/min)、纯水仪。5.2用具z线虫挑针、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液器(1000L、100L、10L、2.5L)、钟面皿(7 cm、树cm)、培
6、养皿(7cm、拘cm)、浅盘、套筛(400目、500目)、改进的贝尔曼漏斗、加热板、打孔器、解剖刀。6 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂或双蒸水。6. 1 玻片封固剂、4%甲醒榕液、石蜡。1 GB/T 29585-2013 6.2 10XPCR缓冲液一20c保存、25mmol/L氧化镖(一20.C保存、2.5mmol!L dNTPs( -20 c保存)、5U/LTaq酶(-20c保存)、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、澳酣蓝载样缓冲液(6XTAE缓冲液、60%甘油、0.3%澳酣蓝，4c保存)、漠化乙键(阻，避光保存)、DNAladder marker(一20c保存)。6.3
7、 剪股颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆(一20c保存)。7 现场检测7. 1 抽样按照SN/T2122抽取进出境的草籽、植物样品。7.2 外现症状的检查和取样剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序，被寄生的小花的颖片、外释和内秤显著伸长，其内的子房变成雪茄状的虫瘦z虫瘦开始形成时为绿色，后变为褐色。收集上述可疑的草籽、植物材料带回实验室检验。8 实验室栓验8. 1 钱虫分离8. 1. 1 浅盘和漏斗法E直接分离待检样品，室温(25c左右)条件下分离12h.24 h，可获得线虫。8. 1.2 人工筛检虫瘦z对于草籽，除浅盘和漏斗法直接分离样品外，可根据剪股颖粒线虫危害寄主引起的症状特点人工挑拣虫瘦，嵌得
8、虫瘦后，在清水中浸泡1h.2 h，体视显微镜下挑针轻庄，也可获得线虫。8.2 显微观察、摄影和测量在体视显微镜下挑取线虫若干条制成临时玻片在显微镜下镜检，观察线虫的形态结构。同时对线虫进行拍照、测量。当虫量足够时，拍摄测量的雌虫、雄虫或幼虫数目应在15条以上。8.3 分子生物学栓测对形态学观察可疑的钱虫幼虫应进行分子生物学检测。9 鉴定与检测9. 1 形态学鉴定9. 1. 1 粒结虫属形态鉴定特征成熟雌虫肥大，体型中等到大，长1mm2. 7 mm，呈螺旋形。中食道球有瓣:后食道腺膨大，与狭部之间连续或锺缩，通常覆盖肠，偶尔不覆盖肠。雌虫卵巢前部转折，卵母细胞围绕一中轴多行排列，子宫柱状部由多行
9、不规则细胞排列构成。雄虫精原细胞多行排列F有引带F交合伞亚端生，长但不伸到尾端。一般在寄主植物地上部形成虫瘤。9. 1.2 剪股颖粒钱虫形态鉴定特征9. 1. 2. 1 雌虫E虫体粗壮，经热杀死后向腹面卷曲成螺旋形，角质膜表面环纹细，在成虫的虫体上难于观察到侧带区。唇区低平，锺缩。垫刃型食道，食道前体部圆柱形，中部略膨大，与中食道球连接处稍锺GB/T 29585-2013 缩z狭部短而窄z后食道腺发达，梨形，不呈明显耳叶状，不覆盖肠的前端或稍覆盖。前生殖腺发达，卵巢常折叠2次，卵母细胞围绕一中柱轴状多行排列，受精囊长梨形，与输卵管连接处稍缆缩分开，子宫内常有多个卵同时存在。后阴子宫囊的长度为虹
10、阴距的一半，内充满精子。尾锥形，尾端锐尖。9. 1. 2. 2 雄虫:虫体比雌虫短而细，经热杀死后一般呈弓形。精巢常回折1次，精母细胞多行排列。交合剌比小麦粒线虫A.tritici的纤细，近端部向腹面折或不折，引带细线形。交合伞亚端生。尾端锐尖。9. 1. 2. 3 2龄幼虫E除生殖系统未发育及虫体较小外，其余形态结构与成虫相似。9. 1. 2. 4 近似种z小麦粒线虫A.tritici。两者的区别是z小麦粒线虫尾端钝圆，交合刺中部明显增粗，基端头状突腹折，引带槽状，寄生小麦和燕麦;而剪股颖粒线虫则是尾端尖，交合剌中部仅略增粗，基端头状突不腹折或略腹折，引带细线状，寄生牧草。9. 1.3 剪股
11、颖粒钱虫形态特征圈参见附录B.9. 1. 4 剪股额粒结虫测计值见表1.表1剪股颖粗钱虫形态测量数据测量项目剪股颖分离物早熟禾和假梯革分离物和参数雌虫雄虫2龄幼虫雌虫雄虫L/mm 1. 392. 60 1. 05-1. 45 O. 550. 82 2.52-4.14 1. 54-2. 31 a 13.8-25.4 23.8-30.。47.2町、021. 8-30. 7 21. 6-34. 4 b 12.6-28.7 6.5-8.9 3.2-4.5 10.3-26.5 6.8.11.6 c 25.2-43.。21. 5-28. 4 11.7-20.。28.8-48.9 20.4-32.7 V 8
12、792 90-92 口针/m10-12 10-12 10 10-12 1012 交合刺/m一25-32 3-37 引带/m10-13 13-15 注:L:线虫体*-;a:体长/最大体宽;b:体长/虫体前端至食追踪与肠连接处的距离;C:体长/尾长pV:虫体前端至阴门的距离Xlol体长。9.2 分子生物学检测见附录C。10 结果判定2龄幼虫0.81-1. 25 43.5-71.0 4.0-6.1 12.1-15.4 10 符合9.1形态特征的粒线虫成虫，可判定为剪股颖粒线虫;符合9.1形态特征的粒线虫幼虫，经9.2特异引物扩增获得的PCR产物约为500bp，同时阳性对照的PCR产物约为500bp，
13、空白对照元PCR产物时，也可判定待检线虫为剪股颖粒线虫。3 GB/T 29585-2013 11 样晶保存11. 1 如果鉴定结果为剪股颖粒线虫，则将剩余的线虫杀死，置于4%甲醒固定液中或制成永久玻片长期保存。11.2 对已经鉴定出带有剪股颖粒线虫的植物材料，保存在低温干燥、防鼠防虫处，并注明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具、输出国名等。样品保存期为1年，有特殊需求保存期可适当延长，以备复验、谈判和仲裁。保存期满，经灭活后妥善处理。4 GB/T 29585-2013 附录A(资料性附录)剪股颖粒线虫的其他信息A.1 地理分布中国(内蒙古局部)、爱沙尼亚、德国、俄罗斯、法国、芬兰、
14、格鲁吉亚、荷兰、瑞典、乌克兰、英国、南非、澳大利亚、新西兰、加拿大、美国(太平洋沿岸A.2 寄主植物A. 2.1 剪股颖属草类z细弱剪股颖Agrostistenuis、小糠草A.alba、绒毛剪股颖A.canina、糙叶剪股颖A. exarata、匍甸剪股颖A.palustris、匍茎剪股颖A.stolonifera等。A.2.2其他禾本科牧草和杂草:A pera s Pica venti、Arcatagrostislatifolia、野牛草Buchloedactyloides、加拿大拂子茅Calamagrostiscanadensis、兰斯多夫拂子茅c.langsdorfii , Digra
15、phis arundinasea、羊茅Festucaovina、紫羊茅F.rubra、芒麦草Hordeum j ubatum、Koeleriaglauca、黑麦草Loliumerenne、假梯牧草Phleumphleoides、高原早熟禾Poaalpina、早熟禾P.annua、六月禾P.ratensis、海滨碰草Puccinellia、maritima、Sorobolusbrockmanii、黄三毛草Trisetumflavesce町等。A.3 危害症状剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序，被寄生的小花的颖片、外秤和内秤显著伸长，其内的子房变成雪茄状的虫瘦。虫瘦开始形成时为绿色，后期变为紫褐色，长
16、约4mm 5 mro.而正常的颖果长约1mm。被线虫寄生的花的浆片、花柱以及花的其他部分发育均受到抑制。A.4 生物学剪股颖粒线虫每年发生1代，完成1代大约需要3周4周。2龄幼虫只有侵人正在发育的花序，才能在子房内发育成成虫。每条雌虫可产卵1000余粒。在干燥的虫瘦内，该线虫以休眠2龄幼虫虫态可存活10年。5 GB/T 29585-2013 剪股颖粒线虫形态特征见图B.l.说明EA 雌虫zB 一一雄虫sC 一一雄虫食道区zD 雌虫尾FE.F 雄虫尾sG 交合剌和引带.注=图B.l引自T.Goodey. 1930. 附录B(资料性附录)剪股颖粒钱虫形态特征固固B.1剪股颖粒线虫Anguinaag
17、rostis 6 200 A、B50 C 100 D、E、F旦旦G GB/T 29585-2013 附录C(规范性附录分子生物学检测流程C.1 DNA提取剪股颖粒线虫DNA的提取方法如下。也可以使用实验室成熟稳定的DNA提取方法或市售DNA提取试剂盒提取。C. 1. 1 洗涤钱虫用挑针挑取活体粒线虫(Anguina)幼虫若干条，放人去离子水中洗涤3次，备用。C. 1. 2 切割结虫在拮净的载玻片上加10L去离子水，挑人35条经过洗涤的线虫，用解剖刀将每条线虫切成2段3段，连同8L去离子水吸入到200L的离心管中。C. 1.3 DNA提取在上述管中加入1.0L10XPCR-缓冲液、1.0L蛋白酶
18、K(1000.g/mL)后放冰箱中低温(-20.C) 冷冻至少30min。将冷冻后的线虫取出，迅速放入PCR仪中，65c条件下保温1h2 h ,95 c条件下保温10 min，即获得线虫的DNA模板。C.2 常规PCR检测C.2.1 引物上游引物AgrF:5 -CATTCTT ACAGCCAATAGTCTG-3。下游引物AgrR:5 -TGACTCT AGCGGAGTATCG-3。C.2.2 PCR扩增C. 2. 2. 1 根据表C.1将线虫的DNA模板及相关试剂加人200L的PCR管中。表C.1 常规PCR反应体系(50IL)溶液用量终浓度5L 10XPCR-缓冲液1XPCR-缓冲液4L 2
19、5 mmol/L氯化侯2.0 mmol/L氯化续2L 2. 5 mmol/L dNTP s 0.1 mmol/L dNTPs 2L 10 pmol/LAgrF 0.4mol/L AgrF 2L 10 pmol/L AgrR O. 4 Imol/L AgrR 0.4L 5 U/LTaq-酶2 U Taq-酶8LDNA模板去离子水26.6L的FON-mmmNH阁。GB/T 29585-2013 C.2.2.2 按照如下PCR反应程序进行扩增:94c ,4 min;94 c ,40 5 , 58 .C , 40 5 , 72 c , 90 5，40个循环;72 c ,5 min; 4 c保存。以剪股
20、颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆作为阳性对照，以灭菌的去离子水作空白对照。电泳制作1.5%的琼脂糖胶，取PCR反应产物5L，加入1L澳酣蓝载样缓冲液(6XTAE缓冲液，60%甘油，0.3%澳酣蓝;4 c保存)，充分混匀后移人胶孔。样品的两侧分别加入100bp DNA ladder Marker, 100 V电压下电泳(10V/cm)。C.3 凝肢成像将电泳后的凝胶小心地转移到1g/mLEB溶液中染色30min，再将胶块小心地转移到凝胶成像系统中，观察是否有500bp的目标片段，拍照保存。C.4 侵权必究铸书号，155066.1-47526定价，16.00元版权专有GB/T 29585-2013 打印H期:2013年10月10日F002
