1、GBjT 5413.12-1997 快.前圭E二，本标准给出两种方法，方法一是荧光法，重现性好，准确度高。方法二是高压液相色谱法，测定速度本标准方法一为仲裁法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85。本标准由中国轻工总会提出.本标准由全国乳晶标准化中心归口。本标准负责起草单位s国家乳制品质量监督检验中心、浙江省轻工业研究所。本标准参加起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国投资服务有限公司a本标准主要起草人.李茂胜、任一平、黄百芬、郎昭斌、陈青俊、王芸。268 中华人民共和家标准婴幼儿配方食品和乳粉维生素矶的测定Milk powder and rormul
2、a roods ror inrant and young chlldren 一Delermlnatlonor vitamin B, conlent 1 范围本标准规定了用荧光法和高压液相色谱法测定维生素B，的方法。GB/T 5413.12一1997代替GB5413-85 本标准方法一适用于乳粉中维生素弘含量的测定P方法二适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素民的测定。方法一荧光法2 方法I要样品在稀盐酸溶液中经消化，调整pH值，过滤，除去蛋白质等物质后，滤液加高锺酸饵氧化除去干扰物，此溶液中维生素鸟在激发波长440nm、发射波长565nm下可产生最大荧光强度，与标准样品做对照试验，可得维生素乌含量
3、。3 试弗j所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水.如未注明其他要求，均指兰级水。3. 1 盐酸，c(HCl)为O.1mol!L。3.2 氢氧化销:c(NaOH)为400g/Lo3.3 冰乙酸。3. 4 高锺酸仰，c(KMnO，)为40g/Lo3.5 过氧化氢g体积分数为3%。3.6 连二亚硫酸销(NaS，O， 2H，O)。3.7 维生素B，标准溶液3. 7. 1 维生素B，标准贮备液，浓度为100g/mLo准确称取于暗处五氧化二磷条件下干燥过夜的维生素B，50.Omg.溶于0.02mol!L的乙酸中，定容至500mL.甲苯条件下于冰箱中保存。3. 7. 2 维生素B，标准中间液，浓
4、度为10g/mL。用O.02mol/L乙酸稀释100mL标准贮备液至1000mL.在甲苯条件下于冰箱中保存。3.7.3 标准工作液，维生素B，的浓度为1严g/mLo用水稀释10mL标准中间液至100mL。当天配制。国司R技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施269 4 仪器常用实验室仪器及24. 1 荧光分光光度汁。5 操作步骤5. 1 抽提GB/T 5413. 12-1997 于150mL=角瓶中准确称取5g左右样品，加入盐酸(3.1)60mL，用铝稿纸盖住瓶口，在137.2-161. 7kPa压力下(125C)消化30min后用氢氧化锅(3.2)调节pH至5.8，再用盐
5、酸(3.1)调节pH至4. 5，将此抽提液移入100mL容量瓶中以蒸馆水定容，过滤，吸取25mL滤液于250mL容量瓶中，用蒸馆水稀释至刻度。5. 2 抽提液的氧化5.2. 1 吸取4份样品抽提液(5.1) ，每份10mL，于4个试管中。5.2.2 于其中二个试管各加1mL标准工作液(3.7. 3)。5.2.3 于另外二个试管中各加1mL水。5.2.4 加1mL冰乙酸(3.3)于每一试管中，混匀。5.2.5 加高锺酸仰溶液(3.4)0. 5mL于每个试管中，混匀。5.2. 6 2min后各加过氧化氢(3.5)0.5mL，混匀，使其褪色。5. 3 荧光测定依次测定每管荧光强度，激发波长440nm
6、，发射波长565nm。样液管(未加标准工作液者经荧光测定后，各加20mg连三亚硫酸纳(3.6)混匀，立即测定荧光，在5s内读数。6分析结果的寝述(1, - 1.) X c x D 样品中维生素B，含量(mg/100g)=一一X 100 (1.一1，)X 10 X m X 1000 式中，h一一空白样品荧光值，1，-样品荧光值，1. 样品加标样荧光值3c一一标样质量浓度llg/mL，D 样品稀释倍数em一样品的质量，g。, -1一注2tTt值必须在O.66 1. 5之间.7 允许黎同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%。方法二高压液相色谱法8 方法提要. ( 1 ) 祥品在稀盐酸环境
7、中高温水解、酶解，经ODSC反相色谱柱分离，在荧光检测器(E.，462，Em，522nm)中检测，用外标法定量维生素B，的含量。270 GB/T 5413. 12-1997 9试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。9. 1 浓盐酸。9.2 无水乙酸钩。9.3 冰乙酸。9.4 甲醇g色谱纯。9.5 核黄素(维生素B，)，标准品。9.6 盐酸溶液，c(HC)为0.1mol/L。吸取4.5mL浓盐酸，溶于500mL去离子水。9. 7 盐酸溶液，c(HC)为0.01mollL。吸取上述。1mollL盐酸50mL，配制成500mL。9.8 乙酸销溶液(pH=
8、4.5) ，c(NaAc)为0.05mol/L。称取4.10g乙酸纳固体，配成1000mL，并用冰乙酸调至pH=4.509. 9 乙酸锅溶液，c(NaAc)为2.0mol/L。称取16.61g乙酸销，配制成100mL。9.10 混合酶溶液:30g/L。称取淀粉酶和木瓜酶各3.句，溶于100mL2mol/L乙酸销溶液。9.11 流动相配制:用0.05mollL乙酸销溶液与甲醇按适当比例混合。9.12 标准溶液9.12.1 标准储备溶液，维生素民的浓度为500吨/mL。精确称取0.0500g维生素B用0.01mollL盐酸(9.7)溶解并定容于100mL容量瓶中，放入冰箱中保存。9. 12. 2
9、标准工作液，维生素岛的浓度为O.5问/mL。在测定时，将标准储备液用重蒸水再稀释1000倍，所得溶液经O.3m滤膜过滤。10 仪器与设备常用实验室仪器及g10. 1 高效液相色谱仪或具同等性能的高效液相色谱仪。10.2 荧光分光仪带9L流动池)或具波长可调功能的同等性能荧光检测器。10.3 C18反相色谱柱(dp5m，25cmX4.6mm)或具同等性能的色谱柱。10.4 组织捣碎机(1000012000r /min)。10.5 高压杀菌锅。11 操作步骤11. 1 样品处理11.1.1 称样z将样品放入捣碎机中捣碎后，精确称取5.010. 0 g(内含维生素B，5E以上)于三角瓶中。11.1.
10、2 水解2加适量的盐酸(9.6)，控制样液中酸浓度在0.1mollL左右，将三角瓶内的样液摇匀后，放入高压杀菌锅内，在121C下保持30mn待冷却后取出，轻摇数次。11.1.3 酶解z冷却至40C以下，分别加入2.5mL混合酶液(9.10)，摇匀后，置于37C培养箱中过夜。11. 1.4 定容:用。1mollL氢氧化纳将样液pH值调节至6.0左右，再用二次重蒸水定容至100mLo 11.1.5 过滤g样液经定量滤纸过滤，接取少量滤液以备进样。11 , 2 样品测定11. 2. 1 色谱条件流动相:0.05 mol/L乙酸销溶液(9.8):甲醇(9.4)(65:35，体积比)。271 GB/T 5413.12-1997 流速:1. OOmL/min。检测波长z激发波长462nm.发射波长522nmo12 分析结果的寝述cX F X V X 100 样品中维生素岛的含量(mg/100g)二、，式中:C一一进样祥液的浓度，g/mL，F 稀释倍数gV一一定容容积，mL，r一样品的质量.go13 允许直13. 1 重复性同一样品两次测定结果之差不得超过平均值的5%。13. 2 重现性同一样品在两个实验室测定结果之差不得超过平均值的5%。272 . . ( 2 ) 、
