1、GB/T 541 3. 15-1997 前当口本标准给出两种方法，方法一是微生物法，为等同采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法，虽然操作步骤繁杂，但测定结果准确度高。方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一种快速、准确的方法。本标准方法一为仲裁法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85。本标准由中国轻工总会提出.本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位2国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位s卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国投资服务有限公司。本标准主要起草人g杨金宝、鄂来明、王芸、刘波。281 中华人民共和国国家标
2、准婴幼儿配方食品和乳粉和烟酷朦的测定Mllk powder and formula food. for infant and young children -Determlnatlon of vltamln PP content 1 范围GB/T 5413. 15-1997 代替GB5413-85 本标准规定了用微生物法和反相高压液相色谱法测定烟酸和烟戳胶的方法.本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中烟酸和烟酷胶的测定，方法二适用于婴儿配方乳粉中烟酸和烟冒险胶的测定.方法-微生物法2 方法键要通过对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)生长的酸度测定来评价烟酸和烟酷胶的含
3、量。3 试剂、菌种和培弊基所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 硫酸溶液.c(H，SO.)为lOmol/L。将质量分数为95%98%的280mL浓硫酸缓慢加入到600mL水中，边加边搅拌，冷却，定容到lOOOmL 3. 2 硫酸溶液.c(H，SO，)为lmol/L。将lOOmLlOmol/L的硫酸溶液(3.1)用水稀释至lOOOmLo3. 3 氢氧化锅溶液.c(NaOH)为150g/Lo将150g氢氧化纳溶解在盛有400mL水的烧杯中，该烧杯放入冷水浴中，冷却后，再用水稀释至lOOOmL.搅拌，转移到试剂瓶中。3.4 盐酸溶液.c(HC)为O
4、.lmol/Lo吸取lOmol/L的盐酸溶液lOmL.用水稀释至lOOOmLo3. 5 氢氧化纳溶液，c(NaOH)为O.lmol/Lo用水稀释lmol/L的氢氧化销溶液lOOmL至lL.用邻苯二甲酸氢饵标定。3.6 乙醇溶液，体积分数为25%。将体积分数为95%的乙醇溶液250mL，用水稀释至950mLo3. 7 菌种:植物乳杆菌(Lactoba口llus户lantarum)。3.8培养基3. 8. 1 乳酸杆菌琼脂培养基z光解腺15g，葡萄糖1饨，番茄汁lOOmL.磷酸二氢饵址，聚山梨糖单汹酸酶19.琼腊1饨，加蒸馆水至lOOOmL.pH6.8士O.2(25C)。国家技术监督局1997-0
5、5-28批准1998-09-01实施282 GB!T 5413. 151997 3.8.2 乳酸杆菌肉汤培养基z光解陈15日，葡萄糖10g.番茄汁100mL.磷酸二氢僻栓，聚山梨糖单泊酸醋19.加蒸馆水至1000mL.pH6. 8士0.2(25C)。3. 8. 3 烟酸测定用培养基g维生素测定用CasaminoAcids 12g，葡萄糖4饵，乙酸纳20日.L-JlIt氨酸。.句，DL-色氨酸。.钮，盐酸腺瞟岭20mg.盐酸鸟嚓岭20mg.尿嘈睫20mg.盐酸硫胶素200g.泛酸钙200阔，盐酸咣哆醇400g.核黄素400g.萨氨基苯甲酸100g.生物素。.8g.磷酸氢二御19.磷酸二氢饵19
6、硫酸续O.饵，氯化销20mg.硫酸亚铁20mg.硫酸锺20mg。加蒸馆水至1000mL.pH6.7土0.2(25C)。4 仪器常用实验室仪器及spH it 0 5制j备5. 1 接种的制备从植物乳杆菌(Lactoba口llusplanlarum)贮备菌种中移取部分菌体到灭菌的10mL液体培养基中。选择30C(士0.5C)-35C(土O.5C)之间恒温培养18-24h。5.2 标准溶液的制备5. 2. 1 烟酸标准贮备液，浓度为100g!mLo从五氧化二磷干燥器中取出标样，精确称取50-60mg尼克酸，溶解在乙醇溶液(3.6)中，继续加乙醇榕液，使尼克酸的准确含量为100g!mL.放入冰箱。5.
7、2.2 烟酸标准中间溶液，浓度为10g!mL从标准贮备液(5.2. 1)中吸100mL.加体积分数为25%乙醇溶液至1L.贮于冰箱中。5.2.3 标准工作溶液，烟酸的浓度10Ong!mL。从标准中间液(5.2.2)中吸5.0mL.用水稀释至500.0mL每次使用前重新制备该标准溶液。6锦作步骤6. 1 测定溶液的制备精确称取一定量样品，约含烟酸O.lmgo转入250mL烧杯中，加10倍于干粉质量的2mol/L的硫酸溶液.充分混合样品，用1mol/L的硫酸溶液(3，2)洗节瓶口边上的样品.121c灭菌30mn，冷却。要充分搅拌，直到颗粒分散。充分搅拌，用氢氧化纳溶液(3.3)调pH值6.0-6.
8、5.迅速加入盐酸溶液(3.4) .直到不再有蛋白产生(pH4.5是许多蛋白质的等电点儿用水稀释混合物到100mL.过滤。如果很难过滤，离心或通过过滤板过滤。吸25mL上清液到100mL烧瓶中，充分搅拌，调pH6.8(用3.5).移入到250mL带有刻度的容量瓶中，用水稀释到刻度，如产生絮状，再过滤-6.2 标准曲线的制备按表1顺序加入蒸馆水，标准溶液和培养基于试管中，一式三份。表1试管号No.I 2 3 4 5 6 7 蒸馆水.mL5.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1. 0 0.0 标准溶液.mL0.0 0.0 1. 0 2, 0 3. 0 4.0 5. 0 培养基.mL5.0 5.0
9、5.0 5.0 5.0 5.0 5, 0 6.3样品283 GB/T 5413.151997 按表2顺序加入蒸饱水、样品和培养基于试管中，一式三份。表2试管号N。I 2 3 4 蒸馆水.mL4.0 3.。2. 0 .0 样品.mL1. 0 2. 0 3.0 4目。培养基.mL5. 0 5.0 5.0 5. 0 6.4 灭菌直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀(灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响)，121C灭菌10minc6.5接种无菌地接种每个管，均加入一滴适当的接种物。除标准曲线中试管No.1以外。盖上盖，充分振荡所
10、有管。6.6 培养在2840C之间选择一个恒定温度(士O.5 C ) .培养6072ho6.7 测定(酸度法)试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是糟的，标准溶液和样品溶液中无其他菌生长。用澳麟香草酸蓝作指示剂，用氮氧化纳溶液(3.5)滴定每个管中溶液，或以pH6.8为电位滴定终点。如果接种空白漓定反应等于或高于未接种空白水平的1.5mL.则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.0mL的反应等于c(NaOH)=O.lmol/L的氮氧化销溶液812mL的滴定度。7 分析结果的褒述X F 样品中烟酸含量(mg/100g或1OOmL) = - x一c:
11、-:oX 100 m . 1000 式中:X从曲线中查得的样品中烟酸的平均含量，用，F一一稀释因子，m一一样品的质量或体积.g或mL，8 允许差同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二反相高压液相色谱法9方法提要样品经热水萃取、酸性沉淀蛋白质后，以反相C18色谱柱分离，用紫外检测器定量。10试111110. 1 盐酸溶液:c(HCll为5.0mo1/L。10.2 氮氧化纳榕液:c(NaOH)为5.0mo1/L10.3 高氯酸g体积分数为60%。10.4 无水甲醇z色谱纯.10.5 异丙醇g色谱纯。284 ( 1 ) 10.6 辛烧磺酸销g优级纯。10.7 标准溶液GB/T
12、5413. 15-1997 10.7.1 烟酸及烟酿胶标准中间溶液，浓度为100g/mL称取烟酸及烟酸胶标准品各10.Omg.用水溶解，然后分别定容至100mL容量瓶中。10.7.2 烟酸及烟商量胶混合标准工作溶液，浓度为5g/mL.各取5.OmL 1:述标准中间溶液于100mL容量瓶中，用水定容(烟酸、烟麟胶浓度均为5g/mL)。11 仪器常用实验室仪器及211. 1 高效液相色谱仪s带紫外检测器。11. 2 色谱柱ol5cmX4.6mm.或间等性能的反相C18柱。11. 3 酸度计。11. 4 超声波振荡器。12 操作步骤12. 1 样品预处理12. 1. 1 称样z精确称取样品5.000
13、g.放入100mL锥形瓶中。12.1.2 提取s在上述锥形瓶中，加入约60C的蒸馆水25mL.摇匀后，置于超声波振荡器中振摇10min。12. 1. 3 沉淀g待样品榕液降至室温后，用盐酸溶液00.1)调节样品溶液的pH值至1.70.放置2min后，再用氢氧化销溶液00.2)调节样品溶液的pH值至4.50。12. 1. 4 定容z将样品溶液转至50mL容量瓶中，用蒸馆水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于50mL容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗中自然过滤。取此滤液约10mL.经O.45m微孔滤膜加压过滤，用10mL试管收集此滤液，即样品备用液。12.2 仪器工作条件检测器灵敏度，0.002AU/mV
14、, 检测器波长，261nm，位温，25C。流速，1.OOmL/min. 流动相z体积分数为7.0%的甲醇、体积分数为2.0%的异丙醇、19/L辛烧磺酸纳的水溶液，用高氯酸调pH=2.10，12.3 定量分析12. 3. 1 上机样液的配和tl，准确吸取样品备用液1.OOmL及1.OOmL蒸馆水，合并于试管A中，此为A液，另准确吸取1.OOmL样品备用液及1.OOmL标准工作液，合并于试管B中，此为B液。12. 3. 2 上机测定:注射一定量的A液进入液相色谱仪，得到峰面积Ai;注射与A液相同体积的B液进入色谱仪，得到峰面积丘。13 分析结果的寝述样品中维生素pp的含量(mg/100g)= X , + X, . ( 2 ) 式中，X，一一样品中烟酸的含量.mg/100g;X, 样品中烟默胶的含量.mg/100g。其中X，或X285 式中m样品的质量.g，GB/T 5413.15一1997A; X c, X V X 100 XI012(mg/100g)骂m(B; - A ,) X 1000 A;一一由12.3.2所得的A液的峰面积，B;一一由12.3. 2所得的B液的峰面积gc，一-标准工作液中烟酸或烟酷胶的浓度，问/mL，V一一样品溶液的体积.mL。14 允许肇同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。286 . ( 3 )
