1、GB/T 5413.16一1997前去口本标准等效采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-850 本标准由中国轻工总会提出。本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位z国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位g卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司.本标准主要起草人z殷晓红、王芸、杨金宝、张玉杰。287 中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉叶酸(叶酸盐活性)的测定Mllk powder and Cormula foods for infant and young chl
2、ldren 一DeterminatloDof folic acid (folate activity) 1 范围本标准规定了用微生物法测定叶酸(叶酸盐活性的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中叶酸(叶酸盐活性)的测定2 方法原理叶酸盐的活性通过干酶乳杆菌(Lactobacilluscasei)的生长情况来评价。3 试J、菌种和培弊基GB!T 5413.16-1997 代替GB5413-85 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 鸡膜腺z称取100mg干燥的鸡膜腺，加20mL蒸缩水，搅拌15rnn，离心10min(3000r!min).取上清
3、液用。现用现配.3. 2 生理盐水a称O.9g氯化锁(分析纯)于100mL容量瓶中，稀释至J度，振荡溶解a分装10mLJ每个培养管中，盖上盖.121C灭菌20min，每周准备一次。3. 3 磷酸缓冲液，c(H，PO，)为O.05mol!L.含有抗坏血酸。溶解50mg抗坏血酸于100mLO.05mol!L磷酸缓冲液中，现用现配.3. 4 叶酸，标准晶。3.5 浓氨水。3.6 甲苯。3. 7 菌种g干酶乳杆菌(Lac印lJacillu5casei) 3. 8 培养基.3.8.1 乳酸杆菌琼脂培养基z炼化乳15g.醇母浸膏讼，葡萄糖1饨，番茄汁100mL.磷酸二氢梆2臣，聚山梨糖单油酸酶19，琼脂1
4、0g.加蒸馆水至1000mL，pH6.8士0.2(25C)。3.8.2 乳酸杆菌肉汤培养基.!在化乳15g.酵母浸膏蚀，葡萄糖1饨，番茄汁100mL.磷酸二氢御钮，聚山梨糖单油酸酣尬，加蒸馆水至100mL.pH6.8土0.2(25C)。3. 8. 3 叶酸测定用培养基g酷蛋白陈1饵，葡萄糖4饨，乙酸纳40g.磷酸氢二饵19.磷酸二氢御19.DL色氨酸。钮.L-天门冬氨酸。.饨.L半胧氨酸盐酸盐O.拢，硫酸腺嗦岭10m日，盐酸鸟瞟岭10mg.尿略带10mg.黄嚓岭20mg.聚山梨糖O.地，谷光甘肤5mg，硫酸续O.旬，氯化纳20mg.硫酸亚铁20mg.硫酸锺15mg.核黄素lmg.p-氨基苯甲酸
5、2mg.维生素B64mg，盐酸硫胶素400月，泛酸钙800吨，烟酸800g.生物素20降，加蒸馆水至1000mL.pH6. 7土0.1(25)。3.9氢氧化锅溶液，c(N.OH)为O.lmol/Lo国京技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施288 GB/T 5413.16-1997 4 仪器常用实验室仪器及:4. 1 培养箱。4.2 灭菌釜。4.3 培养管和帽。4. 4 试管振荡架。4.5 接种针和接种环。4.6 pH计。4.7 离心机。5 1b1J备5. 1 菌种的制备5. 1. 1 将纯菌种植物乳抨菌(Lactobacilluscasei)从菌种培养基上接种到三个转接培
6、养基试管中，37C培养24h，每月接种一次，标好，贮于冰箱中。再以每月接种的培养管(4.3)的一支中再接种l支转接培养基，37C培养24h，每周做一次这样的转接，每周从接种管中接种4-5支转接培养基接种管，37C培养24h，标好，作为每日测定用。每月月初从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌种。5. 1. 2 从日接种管中接种一管于菌种培养基中，37C培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min(2000r/min) ，倾去上清液，再用10mL生理盐水(3.2)将细菌细胞清洗，再离心10min(2000r/min)，倾去上清液，再用另外的10mL生理盐水(3.2)清洗。如前面一样离心，奔去上
7、清液，再加10mL生理盐水(3.2)。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水(3.2)中，混合均匀。5.2 标准溶液的制备5.2. 1 标准贮备液，叶酸的浓度500g/mLo精确称取55-56mg叶酸标准品(3.4)，用50mL蒸馆水定量地转入100mL容量瓶中，加2mL氨水(3. 5)。溶液制备后，计算溶液的体积，要求贮备液中叶酸盐的浓度为500g/mL:或简化为:式中:m一一标样的质量，mg;m X 1000 X c 贮备液体积(mL) 一一一一一一100 X 500 贮备液体积(mL)坐立正50 C一标样的纯度，g/100go. ( 1 ) 用蒸饱水稀释溶液至刻度，用吸管加蒸馆水到所要求的计
8、算得到的体积，充分混合，放入红色或棕色瓶子中，贮于冰箱。保存期为4个月。5.2.2 标准中|司液，叶酸的浓度50g/mLo精确吸取10mL标准贮备液(5.2.1)液于100mL棕色或红色容量瓶中，用蒸馆水稀至刻度，充分混合，贮于冰箱中，保存期1个月。5.2.3 标准工作液，叶酸的浓度。.1ng/mL。吸取1mL标准中间液(5.2.2)于100mL棕色容量瓶中，用蒸馆水定容至刻度，混合。再吸该液1mL于100mL棕色容量瓶飞中，定容，源合.再从上液中吸5mL于250mL棕色容量瓶中，用O.05mol/L磷酸後冲液定容到刻度，混合，即为标289 GB/T 5413-16一1997准工作液(0.00
9、01吨/rnL或O.lng/rnL)。每次测定前制备。6 操作步骤6. 1 测定榕液的制备6. 1. 1 粉状样品精确称取一定量的样品(样品中约含有5g叶酸)于100rnL烧杯中，用2530rnL水复原样品，定量地转入100rnL容量瓶中，用蒸饱水定容至刻度。接6.1.3步骤继续。6. 1.2 液体样品吸取定量的样晶，大约含5阔的叶酸于100rnL容量瓶中，用水定容至刻度，接6.1. 3 0 6. 1. 3 溶液中叶酸的质量浓度大约为0.05g(50ng)/rnL。吸lrnL稀释样品和lrnL鸡腆腺(3.1)于一个18rnrnX 150rnrn的带螺旋盖的培养试管中，充分混合。加18rnLO.
10、05rnol/L含抗坏血酸的磷酸缓冲液(3.3).再加lrnL甲苯(3.5) 0作一个空白对照管，吸lrnL蒸馆水和lrnL鸡膜腺子空白管中，也加0.05rnol/L缓冲液(3.3)18rnL及lrnL甲苯(3.5)。于3TC培养样品管和空白管16h.再于121c灭菌10min，之后离心，用0.05rnol/L磷酸缓冲液稀释，得到叶酸盐的质量浓度约为O.lng/rnL的溶液。6. 2 标准曲线的制备按表1顺序加入蒸馆水，标准溶液和叶酸测定用培养基于培养管中，一式三份。表l试管号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 燕帽水.mL5 5 4 3 2 1 。2 1 。标准溶液1),mL 。
11、1 2 3 4 5 3 4 5 培养基.mL5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1)试管No.3-7中加低浓度标准榕液，No.8-10中加高浓度标准溶液.6.3 测定液按表2顺序加蒸馆水、样品溶液和叶酸测定用培养基于培养管内，一式三份.表2试管号No.1 2 3 4 蒸饱水.mL4 3 2 l 样品.mLI 2 3 4 培养基.mL5 5 5 5 6.4 灭菌直接灭商所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀(灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响)0121C灭离10rnin0 6.5接种无菌的接种每个管，均加入一滴适当的接种物.除
12、标准管No.7以外。盖上盏，充分振荡混合所有管。6.6 培养在2840C之间选择一个恒定温度(士O.5 C ) .培养6072h。6. 7 测定(酸度法试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，来接种管是滑的，标准和样品中无其他离生妖.290 GB/T 5413. 16-1997 6. 7. 1 滴定用澳麟香萃盼蓝作指示剂，用0.1mol/L氢氧化锵(3.9)滴定每个管中溶液，或以pH6.8作为电位滴定终点.如果接种空白滴定反应等于或高于未接种空臼水平的1.5mL.则测定结果应忽略不汁。通常标准溶液在5.0mL的反应等于0.1mol/L氢氧化纳812mL的滴定
13、度。6.7.2测pH值在培养之后读出管内容物的pH值，近似至0.01pH值单位a6.8 计算对于每个标准溶液作出一个浓度反应曲线(酸度.pH值，透射率或吸收值).每个管中分别含有相对应的参考标准含量。对每个水平的检验溶液进行维生素的定量测定，废弃任何低于0.5mL标准溶液的吸收值或高于4.5mL标准溶液的吸收值。对每个水平的检验溶液，计算其每毫升中的维生素含量。计算所得值的平均数，每个管的测得值不得越过该平均值的士15%。如果所得到的管数少于所测定的四种水亭的稀释液的管数的2/3，用于计算样品浓度的数据就是不充分的.如果剩余管数是原来管数的2/3或更多，则可根据平均值计算其样品中的含量.7 分析结果的表述样品中叶酸含量(mg/100g或100mL)=(XX D)-EB22-un-( 2 ) 1000m 式中，X一一不同水平检验溶液其每毫升中的叶酸含量值，ng;D一-1mL样品在经过酶处理后的稀释度，EB-酶处理液空白管中叶酸含量值，ng/mL;m一一最初称(吸)取样品的质量，以或mL)。8 允许直同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。291
