1、GB/T 5413.17-1997 前吉本标准给出两种方法，方法一是微生物法，为等效采用美国公职分析化学师协会(AOA:C)的方法，虽然操作步骤繁杂，但测定结果准确度高。方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一种快速、准确的方法。本标准方法一为仲裁法.本系列标准从实施之日起，代替GB5413-850 本标准由中菌轻工总会提出.本标准由全国乳品标准化中心归口.本标准负责起草单位g因家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位，I卫生都食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢中国)投资服务有限公司。，本标准主要起草人z张玉杰、王芸、殷晓红、杨金宝、吕为群。292 中华人
2、民共和国国家栋准婴幼儿配方食品和乳粉j乏酸的测定GB/T 5413.17-1997 Mllk powder and formllla foods for Infant 8nd young chlldren Determlnatlon of pantothenlc add 1 范围本标准规定了用微生物法和高压液相色谱法测定泛酸的方法.代替GB5413-85 本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸的测定，方法二适用于孔粉中泛酸的测定。方法一微生物法2 方法顺理利用植物轧杆菌(Lactobacillu$刷阳rum)的繁殖量与样品中的泛酸含量成正比的关系可计算出祥品中的泛酸含量。3试剂、菌种和培
3、养基所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验泪水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 生理盐水:9g氯化纳溶于1000mL容量瓶中.3.2 泛酸钙:标准品.3.3 乙酸:c(HAc)为0.2mol/L。吸12mL冰乙酸用蒸馆水稀释至lL。3.4 甲苯.3.5 乙酸纳:c(NaAc)为0.2mol/L.溶解16.4g无水乙酸销于水中，精释至1000皿L。3.6菌种-一植物乳杆菌(Lactobacillus户lantarum)。3.7 培养基3. 7. 1 乳酸杆菌琼脂培养基z光解草1饨，醇母浸膏始，葡萄糖10窜，番茄汁100mLi确酸二氧饵钮，聚山梨糖单油酸醋19.琼脂1饨，加蒸缩水至1
4、000mL，pH6.8士0.2(25C)。3.7.2 乳酸杆菌肉汤培养基z光解陈lSg.酵母浸膏始，葡萄糖1饵，番茄汁100mL.磷酸二氢饵坛，聚山梨糖单泊酸醋19.加蒸缩水至1000mL.pH6.8士0.2(2SC)。3.7.3 泛酸测定用培养基a葡萄糖4饨，乙酸纳2饨，无维生素酸水解酶蛋白l饨，磷酸氧二饵19.磷酸二氢御19.L-胧氨酸。.钮.L色氨酸O.lg.硫酸镑。.句，氯化锵2Omg.硫酸亚铁20mg.硫峻锺20吨，硫酸腺嗦岭20mg.盐酸鸟嗦岭20mg.尿啼睫20mg.胡萝卡素400吨，盐酸硫胶素200g.生物素。.8g.p氨基苯甲酸200悔，烟酸lmg.盐酸毗哆醇800降，聚山梨
5、糖单油酸醋。.19.加燕馆水至1000mL.pH6.7士。.1(2SC).国*技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施293 GB/T 5413.17-1997 4 仪器常用实验室仪器及分光光度计。5制备5. 1 菌种的制备5. 1. 1 将保存在直柱状固体培养基中的植物乳杆菌接种到新的乳酸杆菌琼脂培养基中，培养后再继代培养一次，然后将其转接到乳酸杆菌肉汤培养基中培养后备用.5. 1. 2 将5.1. 1中的菌悬液以2000r/min离心2-3min，倾出上清液，加入10mL生理盐水(3.1), 搅匀，再离心2-3min，如此清洗3次，吸1.0mL该菌悬液于10mL生理盐水(
6、3.。中。5. 1. 3 用721型分光光度计，于550nm波长下，以生理盐水(3.1)做对照，测5.1.2菌悬液的浊度值，此值应在60%-80%之间。5.2 标准溶液的制备5. 2. 1 泛碰标准贮备液，浓度40g/mL。精确称取45-55mg泛酸钙标准品(3.2)，溶入500mL蒸馆水中，加10mL乙酸(3.3) ，加100mL乙酸俐(3.5)，用水稀释至泛酸钙精确浓度为43.47问/mL(即泛酸浓度为40周/mL)，加甲苯(3.4)贮于冰箱中。5.2.2 泛酸中间贮备液z浓度1g/mLo取25mL标准贮备液(5.2.1)，加入大约500mL蒸馆水，乙酸10mL(3.3)，乙酸纳10臼nL
7、(3.日，再用水稀释至1Lo加甲苯(3.4)贮于冰箱中.5.2.3 泛酸标准工作液2商浓度的为10ng/mL，低浓度的为5ng/mL。吸5.0mL中间贮备液(5.2.2)，用蒸馆水稀至500.0mLo每次测定前制备。吸5.0mL中间贮备液(5.2.幻，用燕馈水稀至1000mL。每次测定前制备。6 测定6. 1 样品的处理称取一定量的样品，加入10mL缓冲液称24.2gTrizma Base溶入200mL水中即可)，再加足量的水，121C水解15mi缸，冷却，调pH至4.5，然后定容到250mL，过源，吸4mL滤液，稀释至泛酸的浓度约为5ng!mL.待用。6.2 标准曲线的制备按袭1顺序加蒸馆水
8、、标准溶液和泛醺测定用培养基于培养管中，一式三份。表1试管号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 蕉馆水.mL5 5 4 3 2 I 。2 l 。标准榕液1),mL 。1 2 3 4 5 3 4 5 培养基.mL5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 j).就管No.3-7中加低浓度标准工作攘，1:10.8-10中加高浓度标准工作液.6.3 测定液样品按表2顺序加蒸馆水、样品溶液和泛酸测定用培养基于培养管内，一式三份。291 GS/T 5413.17-1997 表2试管号No.1 2 3 4 蒸偏水.mL4 3 2 l 样品溶液.mL1 2 3 4 培养基.mL5 5 5 5 6.4
9、 接种将6.2和6.3中所有的试管于121C杀菌5min，然后迅速冷却。将5.1.2中的菌悬液用毛细滴管向上述试管内各加一滴(其中标准溶液中试管No1除外).混匀.37C土O.5l:培养19-20ho6. 5 测定以接种空白管做对照，捆.最高浓度标准样管的透光率.2h后重新读数，二次结果透光率;2%.则取出全部检验管测其透光率，并记录。7 计算以标样泛戳含量作横坐标，透光率为纵坐标作工作曲线。根据样品测得的透光率，从标准曲线中查得泛酸含量的平均值，再根据式(1)计算:样品中泛酸含量(mg/100g或mg/100mL)=三-LX100HH-HUH-( 1 ) m . 1000 式中，X一一从曲线
10、中查得样品中泛酸的平均含量，g;F一一稀释因子，m样品的质量(或体积).g(或mL)。8 允许缠同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二高压液相色谱法9 方法提要样品经水提取，过滤，除去蛋白质后，用高压液相色谱测定滤液中泛酸竣基的紫外吸收。10 试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。10. 1 硅嗣树脂s食品添加剂。10.2 盐酸，c(HC)为O.lmol/Lo10.3 硫酸绊，c(ZnSO.)为15g/L。10.4 乙膺z光谱纯。10.5 磷酸二氢御，c(KH2PO，)为0.02mol/L。称取2.72g磷酸二氢饵，加水溶解成
11、100OmLo10.6 乙庸-0.02mol/L磷酸二氧饵溶液g体积比1 90向1体积乙腑中加入9体织的O.02mol/L磷酸二氢饵，用盐酸调节pH为3011 仪器常用实验室仪器及g11. 1 离心机。295 GB/T 5413. 17-1997 11.2 滤膜过滤器z滤膜1.0户m.11. 3 五氧化二磷干燥器.11.4 高压液相色谱仪z带紫外检测器.12 操作步骤12.1 样品溶液的制备 12. 1. 1 准确称取样品约1饨，加60mL水和1滴硅嗣树脂10.1)后，转入离心管中，用盐酸溶液(10. 2)调节pH为4-5，加入10mL硫酸铸溶液(10.3)充分混合，离心分离。12. 1. 2
12、 上清液用滤纸过滤，用100mL容量瓶收集滤液，离心管中残渣用少量水冲洗于同一滤纸上，用少量水洗滤纸，洗液与滤液合并，加水至100mL。经滤膜过滤器11.2)过滤后作为样品溶液。12.2 标准溶液的制备12. 2. 1 泛酸标准贮备液z浓度为lmg/mL.准确称取在干燥器(11.3)中干燥的泛酸钙1.0918g，加水溶解成1000mL。12.2.2 泛酸标准工作液准确吸取标准贮备液(12.2.1)，2，4.8.12mL.分别加水成100mL，作为标准工作液，泛酸浓度分别为10.20.40.80.120g/mL.12.3测定条件填充剂s化学结合型硬脂硅馆。色谱柱g内径6.2mmt妖25cm。洗脱
13、液z乙脯-O. 02mol/L磷酸二氢饵(1 9)。流速.1mL/min。测定波长.200nm。注I 柱的内径和长度可自由选择.2 洗脱液组成比和流速可根据色谱柱情况而改变，没有统一规定.泛酸的保留时间可设定为8-12mino3 泛酸的最大吸收在披长194nm附近，但是移动相在此处也有吸收，所以测定搜长定为200nmo12.4 标准曲线分别吸取10L标准工作液12.2.2).注入高压液相色谱中，根据峰高绘制标准曲线。注，进样量.灵敏度与高压液相色谱的注入方式有关，因此进样量可在320L之间变动.12.5 样品测定准确吸取样品溶液(12.1)10L.注入高压液相色谱仪中，将所得峰高从标准曲线中求出样品溶液中泛酸的浓度。13分析结果的寝述样品中泛酸含量(mg/100g)=旦旦立王X100 .,( 2 ) m 式中.c一一-样品溶液中泛酸的质量浓度，用/100g;m一一称取样品的质量.g.泛酸钙含量(mg/kg)=泛酸含量(mg/100g)X 1. 087 泛酸锅含量(mg/kg)=泛酸含量(mg/100g)X 1. 100 14 允许差同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。296
