1、GB/T 5413. 9-1997 前言测定维生素A、D、E的方法很多，但广为采用的是高压液相色谱法，方法快速、准确，并避免了三种成分的相互干扰。本标准由中国轻工总会提出。本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位a国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、省巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人s杨金宝、王芸。 255 中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定Milk powder and formula foods for lnfant and young children -
2、Determlnation of唱ritaminA, D , E content 1 范围本标准规定了用液相色谱法测定维生素A、D、E的方法。本标准适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素A、D、E的测定。2 方法提要GB/T 5413.9一1997样品中腊溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经(用石油隧萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定。3 试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 高峰氏淀粉酶(Taka-Oiastase)。3.2 异丙醇g色谱纯。3. 3 焦性没食子酸的乙醇溶液:15g/Lo 3. 4 氢氧化饵溶液g质量比为100:
3、 500 3.5 石油隧z沸程3060C。3. 6 甲醇z色谱纯。3.7 正己烧z色谱纯。3. 8 环己烧z色谱纯。3.9维生素A、E标准溶液3. 9. 1 维生素A标准贮备液，含维生素A100g/mL的甲醇榕液。称取10mg的维生素A.用甲醇定容于100mL容量瓶中。3. 9. 2 维生素E标准贮备液，含维生素E400g/mL的甲醇济液。称取40mg的维生素E.用甲醇定容于100mL容量瓶中。3. 9. 3 维生素A、E标准工作液，其中维生素A的浓度为2g/mL.维生素E的浓度为20问/mL。取1mL维生素A标准贮备液(3.9.1)和2.5mL维生素E标准贮备液(3.9.2)于50mL容量瓶
4、中，用甲醇溶解。3.10 维生素D标准溶液3.10.1 维生素0，标准贮备液，含维生素0，100g/mL的甲醇溶液。称取10mg的维生素0用甲醇定容于100mL容量瓶中。3.10.2 维生素0，标准贮备液，含维生素0，100g/mL的甲醇溶液。回京技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施256 GB/T 5413. 9一1997称取10mg的维生素队，用甲醇定容于100mL容量瓶中。3. 10. 3维生素D标准工作液，其中维生素0，、维生素队的质量浓度均为1g/mL.取维生素0，标准贮备液lmL，维生素03标准贮备液ImL于100mL容量瓶中，用甲醇定容。4 仪器常用实验室仪
5、器及24. 1 平底烧瓶:250mL.4.2分液漏斗:500mL. 4.3 旋转蒸发器。4.4 高压液相色谱仪z具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。5 操作步骤5. 1 样品处理5. 1. 1 含淀粉的样品准确称取10g佯品，放入250mL平底烧瓶中，加入IgTaka淀粉酶(3.1)，再加入30mL45-50C的蒸馆水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45C烘箱内30min( 5. 1. 2 不含淀粉的样品 准确称取10g样品.置于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馆水。5.2 测定液的制备5.2. 1 于上述处理过的样品溶液中加入100mL的没食子酸乙醇溶液(3.3)
6、，充分混匀后加50mL氢氧化饵溶液(3.4) ，在蒸汽浴上连续回流30min后，立刻j冷却到室温。5.2.2 将皂化液转入-500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中。5.2.3 于上述分液漏斗中，加入100mL石油酶(3.5)，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇lmi趴在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中。重复上述萃取过程二次，合并酷液到第一个分液漏斗中.用蒸偏水洗该酷液至中性，通过无水硫酸销过滤干燥，在40C和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干(绝不允许蒸干)后，用石油隧转移至10mL容量瓶中，定容，5.2.4 从上述容
7、量瓶中取2mL石油酷溶液放入试管A中.再取7mL石油酿溶液放入另一试管B中，分别用氮气将试管A和B中的石油隧吹干，石油隧溶液放子A中加5mL甲醇，用来测定维生素A、E，试管B中加lmL正己烧，用来测定维生素O.5. 3 测定5. 3. 1 维生素A和E的测定5. 3. 1.1 仪器条件色谱柱，25cmX4.6mm，OOS柱或具等同性能的色谱柱。流动相甲醇。流速:J. OmL/min. 灵敏度，0.005A U /MV。波长2维生素A，325nm;维生素E.290nm.5.3.1.2 注射50L维生素A、E标样(3.9.3)和50L样品溶液(5.2. 4试管A中)，得到标样和样品溶液中维生素A和
8、E的峰高或峰面权。5.3.2 维生素D的测定5. 3. 2. 1 测定液的制备a)仪器条件257 GB/T 5413. 9-1997 色谱柱:30cmX4mm.硅胶柱。流动相s环己统(3.7)与正己烧(3.8)按体积比1 1混合，并接体积分数0.8%加入异丙醇(3.2)。流速:1mL/min. 波长:265nm.往温，20(;。灵敏度:0.005AU/MV。注射体积.200L.b)注射50L维生素D标样和200L样品溶液(试管B中).根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管C中，将试管C用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇(3.6)溶解。5.3.2.2 测定步骤a)仪器条件色谱柱，25cmX4
9、.6mm.C18或具等同性能的色谱柱.流动相g甲醇。流速:1mL/min.柱温，20(; 波*:26Snm.灵敏度，0.005AU /MU. 注射体积.50L.b)注射50L维生素D标准溶液(3.10.3).注射50L样品溶液(试管C中).得到标祥和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。6分析结果的褒述 X 10/2 X 5 X 3. 33 X 100 样品中维生素A(IU/100UZCH. .( 1 ) m 样晶中维生素E(lU/100g)=X 10/2 X 5 X 100 m X 10/75 X 100 X 40 样品中维生意DIU/lOOU=cm X 1 000 A. . ( 2 ) ( 3 ) =LX CMHH-. . . . . . . . . ( 4 ) 式中:c，一一进祥液中维生素A、E或D的质量浓度，何/mL，m一一样品的质量.g，A.一一进样液中维生素A、E或D的峰高或峰面积), A.d，-标样中维生素A、E或D的峰高(或峰面积), C.d一一标样中维生素A、E或D的质量浓度，用/mL.计算结果精确至小数点后一位.7 允许整同样品的两次测定值之差，维生素A不得超过两次测定平均值的5%，维生素D不得超过两次测定平均值的10%，维生素E不得超过两次测定平均值的5%。258
