1、ICS07.100.30 C53 备案号,.L., 玄DB34 侄女省地方标DB34/T393-2004 公用电话机微生物采样与检验方法Collection and Detection Standard ofMicrobes on Public TelepHone Set 准2004-02-12发布2004-02-15实施安徽省质量技术监督局发布DB34rr392-2004 自IJ1=1 本标准规定了公用电话机不同接触部位表面细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、乙型肝炎表面抗原的采样与检验技术规范。本标准由安徽省卫生厅提出。本标准主要起草单位z安徽省疾病预防控制中心，安徽省卫生监督所，宣城地区
2、人民医院本标准主要起草人:徐业林、陈裕秀、张庆、张永根、陆美娟D834厅392-2004公用电话机微生物采样与检验方法1 范围本标准规定了公用电话机微生物指标检测的采样与检验的技术规范。本标准适用于公用电话机细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、乙型肝炎表面抗原的采样与检验工作，其中大肠菌群只适用电话机1-柄，金黄色葡萄球菌只适用电话机送话器的采样与检验工作.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过在本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单川、包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引
3、用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789.28 染色法、培养基和试剂GB5750 生活饮用水细菌总数标准检验方法3 细菌总数的采样检验技术3. 1仪器高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、培养箱36:!:1 c。冰箱、电炉、放大镜。天平、灭菌平皿:直径9cmo灭菌刻度吸管，1m!10mL灭菌棉拭子、灭菌剪刀、PH计或精密PH试纸。3. 2培养基和试剂按GB4789.28规定执行。3.3采样方法采用涂抹法，在无菌操作条件f.J日灭菌生理盐水润湿棉拭子，在选定部位来样，面积5cmX 5cm 范|自内来IJ均匀有顺序地涂抹5次，并随之转动棉拭子用灭菌剪刀剪去棉签于接触部位，将棉拭子放入10m!生理盐水内，
4、记录采样面积，用于结果讨算。4小时内送检。3.4检验方法3.4. 1将放有棉拭f的试管充分振舵，此液为1:10稀释液。以无菌操作吸取2ml检样，分别注入到两块灭菌平皿内，书生皿1m!.II污染严重.flJ 1 f击递增稀释，同l吸取!mlJU到9ml灭菌生理盐水中1昆匀DB34/T3 92-2004 液为1:100稀释液每个稀释度做两块平皿。3.4.2将己融化冷至45C左右的营养琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml.并立即旋摇平皿，冷凝后放36:t IC培养箱培养48士劫。3.5菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时可用肉眼直接观察，必要时用放大镜检查以防遗漏，在记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度
5、各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片的菌落:该平皿不宜计数，若片状菌不到平皿中的一半，而其余半中菌落分布均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，所得结果代表全皿菌落数。实际菌落数按公式(1)计算:、l且II前薄的1均数来样液析释倍数细的总数Ccfucm-) 0 . ( 1 ) 采样lhl积cm2) 3.6各种不同情况的计算及报告方法:技GB5750规定执行。4 大肠菌群的采样与检验技术4. 1仪器高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、培养箱:36:t1C。冰箱、电炉、天平、灭菌平皿=直径9cm。灭菌刻度吸管:1m , 10 ml。灭菌棉拭子、灭菌剪刀、PH计或精密PH试纸。4.2培养基和试剂按GB47
6、89.28规定执行。4. 3采样方法采用大肠菌群快速检验纸片粘贴法，用灭菌生理盐水湿润5cmX5cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别贴于电话子柄正中间前后两侧上.30S后取下，置于无菌期料袋内.4h内送检。4.4检验方法将己采样的纸片置36:t1C培养箱内培养16-18h.观察结果。4. 0纺果报告纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性。纸片变黄，并在黄色背景1:.l.红色斑点或片状红晕均报告检7 检出大肠菌群。5 金黄色葡萄球菌的采样与检验技术5. 1仪器D834厅392-2004显微镜、培养箱36士1(;，离心机、灭菌吸管、灭菌试管、载玻片、酒精灯、革兰氏染色用有关器材。5. 2培养基和试剂按GB
7、4789.28规定执行。5. 3采样方法采用涂抹法，用上述测定细菌总数采集的样品，无需重采。5. 4检验方法5.4. 1将细菌总数检测l后剩余5ml待检样品，放入45ml.17.5%的氯化纳肉汤或膜酷陈大豆肉汤培养基中，36 :1: 1(;培养24士2ho5.4.2从培养液中取1-2接种环，如l线接种在BairdPairker氏培养基(或用血平皿儿子36士1(;培养24h。在BairdPairker氏培养基上菌落为圆形、光滑，凸起湿润，颜色黑灰色，边缘金黄要齐，周围混浊，外层有一透明带，在血平板上菌落号子圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周阁的溶血圈。5.4.3挑取典咛J商落涂片染色镜检，为革兰氏
8、阳性，i;.葡萄状排列。5.4.4甘露醇发酵试验E取上述分离的纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，于36士1(;培养24h，金黄色葡萄球菌向能发酵甘露产酸。5.4.5血浆凝网酶试验玻片法:取清洁干燥玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍旱均匀混浊凝同现象者为阳性，如两者均无凝阴现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与nll浆均有凝网现象，再进行试管凝罔试验。试管法:吸取1:4新鲜血浆。.5ml放入;反菌小试管中再加1入待检菌24h肉汤培养物O.5m 10混匀，3 D
9、B34/T392-2004 放36:!:1 c温箱或水浴中，每半小时观察一次.24h之内如号现凝块即为阳性。同时以己知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各O.5时，分别加入灭菌小试管内0.5ml.1:4血浆混匀，作为对照。5.5结果报告凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性，报告检出金黄色葡萄球菌。6 乙型肝炎表面抗原CHBSAg)的采样与检验技术6.1仪器洗板机、酶标仪6.2试剂PH7.2-7.4 O.OIM PB C含1%小牛血清);HBsAg检测试剂盒CELISA法)。6.3采样方法z在无菌操作条件下，用
10、棉拭了-蘸1圳、牛血清磷酸盐缓冲液CO.Olm.pH7.2-7. 4) .在规定部位和面积范围内来回均匀有顺序地涂抹5次，并随之转动棉拭子，将采样棉拭子浸入1.5ml磷梭盐缓冲液中，带回实验室。将样品置4C冰箱过夜。取浸出上清液用酶联免疫吸附试验CELISA)检测HBSAg.6.4检验方法采用ELISA-双抗体夹心法6.4. 1将微孔条固定于支架按顺序编号。6.4.2分别加待检血清或阴、阳性对照50ul(1滴)于相应孔中，设空白对照孔(加50ul洗涤液).6.4.3除空白对照外，每孔力日酶结合物50u1 C 1滴)。6.4.4振荡均匀，置37C20min.6.4.5洗涤:甩去孔内液体，扣干，用
11、洗涤液注满各孔，静置2min.共三次，每次洗后均需扣干。6.4.6每孔加显色剂A、B各50ul(1滴).振荡混匀，置37C15min. 6.5结果判定4 DB34rr392-2004 酶标仪读数:每孔加2阳，SO，50ul.振荡混匀后在450nm波长读数。P/N值2. 1者判为HBsAg阳性. 2. 1者判为阴性.(阴性对照孔OD值小子0.05时以0.05计)0中j、牛二OD值P I .lt值=一一阴!tN!用债7 采样与检测的质量控制. (2) 7. 1每次采样应对现场采样人员工作前培训，采样时认真填写样品采集记录表，采样记录的编号应与样品编号一致。7.2采样后样品必须尽快进行检测，送检时间
12、应在4h内送达实验室，若样品保存于0-4C则不得超过24ho为防止在运输过程中样品的损失或污染，存放样品的器具必须密封性好，小心运送回7.3送检时按附录A规定认真填写样品检测受理单后连同样品一并交质量管理部门.质量管理部门按内部质量控制运行程序操作，并按规定及时出示检测报告。3 DB341T392-2004 附录A(材料性附录)样晶检测歪理单样品名称规格数量生产日期或批号送保存条件保存期样品性状样品处理要求检验目的提供的其它有关资料11、企标2、无3、其它:检验类别A卫生部抽检B.省E生厅抽检c.省卫生监督所抽检检D本单位抽检E.委托检测F其它FW放射卫生样品HW环境卫生样品K.疾病控制生物样
13、品样品种类LW劳动卫生样品SW食品卫生样品XD消毒杀虫样品XW.学校卫生样品QT其它z检验项臼执行标准检验依据单位是否同意使是否同是否需l是2.否用非标方法意分包要加急填生产单位送检单位地趾邮编电话1传真联系人取报告方式自取邮寄检测结果查询密码写我方保证对所提供的切资料、信息和实物的真实性负责，并提供必要合作。如果样品不足时，可不保留备存样品。送检单位盖章(送检人签字):送检日期2年月日送检单位提交的样品数量是否与上述申报一致:1、是2、否受样品包装是否完整:1、是2、否提供的资料l、有2、无检本中心保证检测的公正性，对检测数据负责，并对委托单位提供的实物和技术资料保密。本中心承诺出具报告的口期为:2003年月口。诸于该旧期后个月内领取检验报告，否则单本单位不予保留。受理人(签字): 受理日期:年月日填样品受理编号a与6
