1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1681-2005 蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法ProtocoI of diagnosis for American foulbrood of honey bees 2005-09-30发布:- 2006皿05酬。1实施号子f一盏础雪斗fFUJipk、中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘟总局EE-雹EE-al -Ea-EE-EE-EE-E EE-EE-2 EEEE -EEE-EE-a -EE-EE-aa -EEE-E a- ,-EE-a Eg-EE-aE -EE-EE- EE-E E-BE-EE - l l -EB-E E-BEZ -| E i -
2、as-Z噩| EE-aE E法制方验断检准诊MW境腐却以栋臭在vd-bds腐创刊一班时虫户44口气共尸itM幼UF民fJf浏阳的S户人提m油、哗唁川存在蜂知耳;UU川骂蜜豆、铃中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9夺开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-2000* 书号:155066 2-16605 定价6.00元SN月1681一2005前本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)制定的陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)，200
3、4版。本标准的附录A、附录B均为资料性晦录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人:陈世松、苏琳、张兆平、朱开元。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法1 范围本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断方法。本标准适用于蜜蜂美洲最1虫腐臭病的检疫。2 原理SN/T 1681-2005 蜜蜂美洲幼虫腐臭病(Americanfoulbrood of honey bees)是由幼虫芽抱杆菌(Paenibacillus larvae)引起蜜蜂幼虫和踊的一种细商性、急性、毁灭性病害。病蜂的蜂盖子牌下陷
4、、穿孔、封盖幼虫死亡，死亡幼虫的朦常从腐烂虫尸前端穿出形如伸出的舌状。幼虫芽抱杆菌外现是长杆状，两端稍菌，呈链状生长的趋势，大小不一，长约2.5 m5 m，宽为0.5mo由于病原是细菌，故可以通过染色或经分离培养后染色，在显微镜下进行形态学检查，可初步得出诊断结论。确诊还需在选择性培养基上进行鉴别培养、生化试验和鉴别试验。3 设备、材料和试剂3. 1 设备3. 1. 1 普通光学显微镜。3.1.2 恒温培养箱。3.2 材料和试剂3.2.1 无菌平血。3.2.2 载玻片。3.2.3 试管(lOmL)o3.2.4 胡萝卡酵母琼脂培养基。3.25 马铃薯培养基。3.2.6 酵母浸膏培养基。3.2.7
5、 牛肉汁琼脂斜面。3.2.8 5%孔雀绿水溶蔽。3.2.9 0.5%沙黄水榕滚。3.2.10 碱性美蓝(又称骆氏美蓝染色液。3.2. 11 稀释石炭酸复红染液。3.2.12 5%的醋酸。3.2.13 元菌生理盐水。4 采样方法及标准4. 1 采样比例一批蜂(幼蜂)数量小于或等于30只时全部采样。数量为30只100只时，以30只采样量为基础，每增加10只，采样量增加1只。数量大于100只时，按每批总数的30%采样。4.2 采样方法从蜂群中随机抽取子牌一张，按照5点式采样方法，分别从巢脾四角与中央各开启封盖幼虫房30个，观察是否有患病幼虫存在。采样时尽量采取变色或死亡幼虫送实验室检查。1 SN/T
6、 1681-2005 5 方法及判定5. 1 直接检褒法5. 1. 1 样品处理取被检样品，加少量元商生理盐水击tl成悬浮液。将上述悬浑液1漓2滴，放在干净的载玻片上涂匀，选择下列2种不同染色方法进行染色后，在普通光学显微镜下检查(1OOOX)。5. 1. 2 孔雀绿、沙黄芽础染色法将被检材料涂片经火焰固定后，加5%孔雀绿水榕液(参见附录A)于载玻片上，加热汽腾3min 5 min，用蒸馆水冲洗后，再加0.5%沙黄水溶踉(参见附录A)复染1min，蒸锢水冲洗，用滤纸吸干，在普通光学显微镜下检查(1OOOX)。结果判定:菌体呈蓝色，芽子包虽红色。5.1.3 石炭酸复红染色和磁性美蓝望染法将被检材
7、料涂片经火焰固定后，加稀释石炭酸复红液参见附录A)于载玻片上，加热汽腾2min 5 min，用蒸俑水冲洗后，用5%的醋酸褪色，至淡红色为止约10s)，用蒸悟水冲洗，以骆民英蓝被(参见甜录A)复染半分钟，用蒸悟水冲洗，吸干或烘干，在普通光学显微镜下检查(1OOOX)。结果判定:菌体呈蓝色，芽抱呈红色。5.2 分离培养与鉴定5.2.1 分离培养5.2. 1. 1 元菌条件下，取备检样品少许于灭菌器皿内，加少量灭菌生理盐水制成悬器液。5.2. 1. 2 将上述悬浮液(也可将悬浮液在800C水播中10min，以杀死不形成芽掘的细商再接种)接种于胡萝卡酵母琼脂(参见附录B)平板培养基或马铃薯培莽基参见附
8、录B)、酵母浸膏(参见附录如培养基上。章是于恒强培养箱中，在300C320C条件下培养24h48 h，取纯培养后的菌落(液)作涂片染色，镜检或生化试验。5.2. 1. 3 被检样品是蜂蜜，可直接取蜂蜜接种于上述培养基上，景于J恒温培养箱中，在300C320C条件下培养24h48 h，取菌辈革(被)作涂片染色，镜检或生化试验。5.2. 1. 4 结果判定:孔雀绿、沙黄芽抱染色法，菌体呈蓝色，芽拖呈红色;石炭酸复红染色和碱性美蓝复染法，菌体呈蓝色，芽抱呈红色。5.2.2 鉴别培养5.2.2. 1 将待定菌株分别接种于胡萝卡酵母琼脂斜固和牛肉、片琼脑参见附录B)斜窟，美洲幼虫腐臭病芽抱杆菌不能在一般
9、培养基上生长，需在胡萝卡酵母琼脂培养基上才能生长。置于恒温培养箱中，在30oC320C条件下培养24h48 h后检查。5.2.2.2 在胡萝卡酵母培养基斜面上生长良好，而在牛肉汁培养斜面上不能生长或生长贫槽，则是美洲幼虫腐臭病病原菌。5.2, 3 生化试验美洲幼虫腐臭病芽抱杆菌能分解葡萄糖、半乳糖、果糖，产酸不产气;不分解乳糖、黯糖、甘露醋、卫矛醇;不水解淀粉;不产生麓基质:缓慢液化明胶;还原硝酸盐为亚硝酸盐。5.2.4 鉴别试验取新鲜牛奶2mL3 mL置试管中，同时加入被检样品或经纯化的菌落少许，充分氓匀;置于恒温培养箱中，在30oC320C条件下培养1h2 ho若发现牛奶出现凝集，随后又发
10、生水解的现象，即为美洲幼虫腐臭病。欧洲幼虫腐臭病病原菌无此反应。2 A.1 5%孔雀绿水溶溜附录A(资料性附录)染色涩的制备SN/T 1681-2005 取5g孔雀撮，先将孔雀绿研细，如适量95%酒精溶液溶解，再加蒸馆水定容至100mLo A.2 0.5%沙黄水溶液取0.5g抄冀，先将沙黄研细，加适量95%酒精溶液洛解，再加蒸馆水定容至100mLo A.3 础性提蓝(又称骑氏美蓝)染色连取美蓝饱和酒精溶液30mL，加入0.01%氮氧化挥水溶液100mL，泪合即成。A.4 稀释石炭酸复红染渣取3%复红酒精溶液10mL，加入5%石炭酸水溶液90mL，融合过洁、，然后再用蒸馆水作10倍稀释。山OON
11、jFFH军SN/T 1681-2005 附录(资料性附录)培葬基的制备B 胡萝卡酵母琼脂培养荔膜蛋白陈10g，无水磷酸氢二铮(K2HP04)0.5g，琼脂3g，胡萝卡浸出液200rnL(将100g洗净的胡萝卡磨碎，加入250rnL 水，静置30rnin，过滤陌成)，酵母浸出被3g，蒸馆7j(1000 rnL , pH6. 80将上述多种成分一起如热溶解(胡萝卡浸出液在溶解后加入混匀)，在0.105MPa的压力下泪毒20rnin B. 1 马铃薯培养基将去皮马铃薯200g切成片，加水1000rnL，煮沸30rnin40 rnin，过滤，将20g右旋葡萄糖和20g 琼脂趁热加入溶化，调节pH值至7
12、.0，在0.105MPa的压力下，高温灭菌15rnino B.2 酵母浸膏培养基酵母提出液1g，葡葡糖1g，无水磷酸氢二饵(K2日P04)1.36g，琼脂2g，蒸懦水100rnL, pH 6.6 , 将以上各种成分混合溶解，在0.068MPa的压力下，高温灭菌20rni丑。B. 3 牛肉汁琼脂斜m牛肉膏1g，蛋白陈1g , NaCl O. 5 g，琼脂2g，蒸锚水100rnL , pH7. 0，将上述各种成分混合，如热榕解，在0.105MPa的压力下，消毒15rnino B.4 户humnupnum 户hum咱EAm。，m. 户humaum num k 俨hum噜iEz-,i 棉一剖6.00元SN/1681-2005
