1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2220-2008 进出口动物源性食品中苯二氮卓类药物残留量检测方法液相色谱一质谱/质谱法Determination of benzodiazepine residues in foodstuffs of animal origin for import and export-HPLC-MS/MS method 2008-11-18发布2009-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检夜总局. . 刚昌本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 2220-2008 本标准起草单位:
2、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:邓晓军、郭德华、李波、朱坚、王敏、杨惠琴、韩丽、樊祥、林黎明、张鸿伟、陈墨莲、董戚、王健、张龙。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 1 范围进出口动物源性食品中苯二氮卓类药物残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法SN/T 2220-2008 本标准规定了动物惊性食品中地西洋、奥沙西洋、氟西拌、去甲基氟西洋、7-氨基氟西洋、利眠宁、氟拉西洋、去烧基氟拉西拌、2捏乙基氟拉西洋、阿普哇仑、自-是基阿普哇仑、咪盹哇仑、-捏基咪皑哇仑、三哇仑残留量的制样和测定方法。本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾中苯二氮卓类药
3、物残留量的检测。2 方法提要试样中的药物残留采用自-盐酸葡萄糖醒民酶水解，在碱性条件上用乙酸乙醋和异丙醇提取，阳离子交换小桂净化，液相色谱-质谱进行测定，内标法定量。3 试荆和材料除非另有规定，均使用分析纯试剂，水为超纯水。3.1 甲醇z液相色谱级。3.2 乙腊:液相色谱级。3.3 乙酸钱。3.4 无水硫酸饷。3.5 乙酸乙醋。3.6 氨水。3. 7 异丙醇。3.8 甲酸。3.9 盐酸。3.10 -盐酸葡萄糖醒试酶芳基硫酸醋酶:含自盐酸葡萄糖醒试酶134600 u/mL，芳基硫酸醋酶5 200 u/mL。3.11 乙酸镀缓冲榕鞭:0.02mol/L , pH=5. 2。称取1.54 g乙酸锻溶
4、解于900mL水中，用冰乙酸调节pH到5.2士0.1，最后用水稀释到1L，于4C贮存，使用期为1个月。3. 12 乙酸乙醋-异丙醇(5+1，体积比):量取1000 mL乙酸乙醋溶液和200mL异丙醇，混匀。3. 13 乙睛F氨水(98+2，体积比):量取98mL乙脯，加入2mL氨水，混匀。使用前配置。3. 14 盐酸溶液(0.1 mol/U:准确量取17mL盐酸(3.的，用水稀释到1L。3. 15 苯二氮卓标准物质:7-氨基氟西洋(7-Aminoflunitrazepam，CAS号:34084-50-9)、地西洋(Diazepam，CAS号:439-14-5)、奥沙西洋(Oxazepam，CA
5、S号:604-75-1)、利眠宁(Chlordiazepoxide，CAS号:58-25-3 )、去烧基氟拉西洋(Desalkylflurazepam，CAS号:2886-65-9)、阿普哇仑(Alprazolam，CAS号:28981-97-7)-捏基阿普哇仑(-Hydroxyalprazolam , CAS号:37115-43-8)、咪盹哇仑(Midazolam , CAS 号:59467-70-8)、口挂基咪盹哇仑(Q-Hydroxymidazolam) ，氟西洋(flunitrazepam，CAS号:1622-62-4)、去甲基氟西洋(N-Desmethylflunitrazepam，
6、CAS号:2558-30-7)、氟拉西洋(Flurazepam，CAS号:1761723-1 )、2-起乙基氟拉西洋(2- H ydroxy let hylfl urazepam , CAS号:29071-53-3)、三哇仑(Triazolam，CAS E -SN/T 2220-2008 号:28911-01-5)、D5-地西拌、D5奥抄西?半、D7-7-氨基氟西洋、D5-阿普瞠仑、队-去烧基氟拉西洋、Ds-a捏基阿普瞠仑。以上标准物质均为1.0 mg/mL的甲醇搭液，同位素内标标准物质为100.0g/mL甲醇溶液。3.16标准中间溶液的配置:用乙脯分别稀释标准物质溶液(3.1日至终浓度约为1
7、.0g/mL和0.1g/mL，低于4.C保存，有效期为6个月。3.17 同位素内标标准中间潜液的配置:用乙脯分别稀释同位素内标标准溶液至终浓度为O.1g/mL， 低于4c保存，有效期为6个月。3. 18 标准工作准的配置2根据需要，临用时吸取一定量的混合标准中间溶液(3.16)和温合同位素内标使用帘液(3.17)，用水稀释配制成适当浓度的提合标准工作溶液(参考线性浓度范围为l.0 ng/mL 20.0 ng/mU ，每mL该程合标准工作榕掖含有同位素内标各5.0吨。低于4.C保存，有效期为3个月。3.19 固相萃取(SPE)小桂:OasisMCX 3.20 微孔滤膜:0.45m。4 仪器和设备
8、4. 1 4.2 涡旋悔合器。4.3 离心机:4000 r/min. 4.4 旋转蒸发器。4.5 分析天平:感量0.1mg和4.6 超声波发生器。4. 7 恒温箱。4. 8 真空过柱装置。4.9 吹氮浓缩装置。4.10 粉碎机。5 试样制备与保存5.1 试样制备从所取全部样品中取出有密封作为试样，标明标记。在5.2 试样保存将试样于一18C保存。6 测定步骤6.1 酶解分成两份，分别装入洁净容器内。或发生残留物含暨的变化。称取5g(精确至0.01g)试样，于50mL塑料离心管中，加入15mL pH为5.2的乙酸镀缓冲溶液(3.11)，在2000r/min下涡旋混合2rnin。添加250L同位素
9、内标物(3.17)于待测样品中。加25L的自-盐酸葡萄糖醒试酶-芳基硫醋酶，加盖后振荡2min，在恒温箱中于37C酶解16h。6.2 提取酶解后溶液用氨水(3.6)调节pH值大于9.5，用15mL乙酸乙醋:异丙醇(3.12)振荡提取5min , 在4000r/min离心5min.上清液过元水硫酸铀小柱于250mL梨形瓶中，重复上述提取操作，合并提取液并在吹氮浓缩装置上，在不高于400C的温度下蒸干。加入5.0mL O. 1 mol/L的盐酸(3.14)溶液溶解残渣。 SN/T 2220-2008 6. 3 净化固相萃取柱(3.19)依次用5mL水、5mL甲醇以1.0mL/min的流速过柱活化。
10、转移样液至固相萃取柱的顶部，以0.5mL/min流速过柱。用5mL水、5mL甲醇淋洗柱，用8mL Y昆合均匀的乙脯，氨水(3.13)，洗脱柱上的待分析成分，井收集洗脱槽，在吹氮浓缩装置上于不高于400C的温度下蒸干。加入1.0 mL乙脯:水(2十的振荡溶解残渣后，过0.45m滤膜。滤液供液相色i普质谱测定。6.4 测定6.4. 1 高效渣相色i曹条件a) 色i普柱:C18柱，150mmX2.1 mm(内径)，3.5m或相当者zb) 流动相:A:乙脯+0.1%甲酸，8:2mmol/L乙酸镀水溶液十0.1%甲酸;流速:200L/min，梯度洗脱程序见表1; 表1梯度洗脱程序表梯度时间Imin流动相
11、B/.%。一5-m一一切一切-m一一-口一-m一幻三hc) 柱温:35OC; d) 进样量:30L。6.4.2 质i曹条件a) 离子源:电喷雾ESI，正b) 扫描方式:多反应监测c) 算化气压力(GSl)、气用前应调节各气体前录A，d) 为高纯氮气或其他合适气体;使达到检测要求，详细条件参见附口电压(EP)、碰撞室出口电压条件参见附录A。(CXP)应优化至6.4.3 定量测定根据试样中被测物的药物含量l!IIIII=?相近的标时(3山同时进行分析。标准工作模和待测液中17种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，应用乙睛:水(2+8)稀释到合适浓度后分析。在上述色谱条件
12、下的待测药物的参考保留时间分别为:7氨基氟西洋(6.7min)、利眠宁(6.8min)眯贴瞠仑(9.4min)、-控基咪盹瞠仑(9.6min)、氟拉西洋(9.7min)、是基阿普瞠仑(13.2min)、奥沙西拌(14.2 min)、阿普瞠仑(14.3 mi川、去甲基氟西洋(14.5 min)、2坦乙基氟拉西洋(14.7mn)、三哇仑(14.7mn)、去:民基氟拉西详(15.9min)、氟西洋(16.5min)、地两洋(1R.5min)，标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B.注:待测药物采用相对应的同位素作为内标，和l眠宁、氟西洋、去甲基氟西洋采用同位素标记的地西洋定量.咪聪唆仑、三哗仑采用同位
13、素标记的阿普嗖仑为内标，-短基眯她哗仓采用同位素标记的-经基阿普I些仑为内标。6.4.4 定性测定按照液相色谱质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶辙，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工3 - SN/T 2220一2008作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%50 允许的相对偏差1%I 土206.5 窒臼试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。7 结果计算和表述2050 土25 10-20 土30用色
14、谱数据处理机或按式(1)计算样品中待测药物残留量。计算结果需扣除空白值。骂王10土50x = _c X Ci X A X Asi X V =( 1 ) C ,j X Ai X As X m X 1 000 式中:X一一一样品中待测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg); C一-一标准工作榕液中药物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mU;Ci一一样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);A一一-样液中药物的峰面积3Asi-一标准工作溶液中内标物的峰面租;v-一样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL);C盯一一标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); A;-一样液中
15、内标物的峰面积3A，;-标准工作溶液中药物的峰面积;m 最终样被代表的试样质量，单位为克(g) 8 测定低限、回收率飞8.1 测定低限(LOQ)本方法肉、肝和肾中的测定低限为1.0g/kg。8.2 回收率各基质中的回收率数据参见附录C.4 附录A(资料性附录)API4000四级杆质谱仪参数1)质谱仪参数za) 电喷雾电压(l曰:4500V; b) 雾化气压力(GSl):344. 75 kPa(50 psi); c) 气帘气压力(CUR):137.9 kPa(20 psi); d) 辅助气流速(GS2):206.85kPa(30 psi); 的离子源温度(TEM):400 oC; SN/T 22
16、20一2008) 碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)见表A.l所示。碰撞室人口电压(EP)为10V、碰撞室出口电压(CXP)为13V。表A.l苯二氮卓及内标碰撞电压、去簇电压参数表序号化合物母离子子离子CEjV DPjV (Q1) (Q3) 222.2 37 80 地西洋285.2 154.2 38 84 24 1. 1 32 70 2 奥沙西伴287.1 269. l 21 64 227.2 32 42 3 利眠宁300. 2 282.28 33 66 274.38 37 100 4 阿普噬仑309.1 205. 1 54 98 297.2 34 84 5 。-经基阿普噎仑325.1 176
17、.1 38 90 29 1. 3 37 94 6 眯即在嗖仑326 .2 244.2 35 86 203. 36 72 7 。-短基咪隧嗖仑342.1 324.2 28 76 268.2 36 86 8 氟酋1半314.2 239.1 45 86 264.2 28 68 9 7-氨基氟西洋284.1 135.2 38 70 254.2 34 70 10 去甲基氟西洋300.1 198.1 51 60 1) 非商业性声明:附录表A.1所列参数是在API4000质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。5 SN/T 2220-2
18、008 表A.l(续)序号化合物母离子子离子CE/ V DP!V (Q1 (Q:n 317.2 33 64 11 氟拉西洋390. 1 290. 2 34 50 109.1 38 78 12 2-经乙基氟拉西洋333.1 246. 1 35 86 226.2 39 94 13 去皖基氟拉西洋289.1 140. 1 42 88 36 9R 14 二工-瞠仑53 88 15 ), -7氨基氟西得32 68 16 D5奥沙西洋29古21 58 17 D.去烧主在氟拉西样39 90 18 D，地西洋38 88 19 Dj阿普瞠仑36 95 20 D5短基阿普哩37 94 a为定量离子对。6 5.5巳
19、45.0e 4.5e 4.0e - 3. 5e 3.0c 2. 5e 吉2.Qe 1. 5e 1. oe 5000. 0 0 4444 teeee nucanuzonu qd句dn41A丘之&-2255000.0 2.2c 2.0 4.00e2.00e nunuUAUAVOWAAURUm unnUAUCORdAa 在PEEC-2000 10 。固B.1 (续9.93 咪盹噎仑326.2/291. 3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1/ mon 8) D5-阿曾唾仑314.1/279.2 14.27 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 f/ tnm 10)
20、16. 81 氟西伴314. 2/268. 2 。2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1/ mm 12) 6.62 D，-7-氨基氟商猝291. 2/271. 2 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1/ n飞m14) 444444000 户HLWiwiwaiuaiunUHNU鼠uaqn4nununwnu-AUnunu q，-AAAAAUnu向。oauaazaobzzzz 2000.0 2.0e g. 1. 5e4 c 1. 0e E 5000.0 1. 8e 1. 6e 1. 4e 1. 2e4 - 1. Oe 、引，B 000.0 6000.0 4 000.
21、0 2 000.0 。14.53 去甲基基氟西拌300. 1/198.1 。2 4 6 8 10 12 14 16 1B 20 1/ mm 15) 14.76 2 -资乙基氟拉西拌333. 1/109. 1 。1/口1m17) 15.86 D,-N去惋基氟拉西拌293. 11230. 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1/口1m19) SNjT 2220-2008 10.17 1. 6e6 氟拉西拌1. 4e6 390. 11317.2 i 喜1.21. Oe6 8.0e4 6.0e 4.0e 2.0e4 。2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1/ mm
22、16) 15.94 2.2e4 2.Oe 1.8e4 1. 6e 丘1.4e4 兰1.2e 1. Oe 吉8000.。- 6000.0 4000.0 2000.0 0 N-去统基氟拉西拌289.1/226.2 2 4 6 8 10 12 14 16 1B 20 11 mm 18) 14.75 6.0e ; 喜5.0e34330B. 2 3.0e 2.0e 1. Oe 。A 10 12 14 16 18 20 1/ mm 20) 固B.l(续)9 SN/T 2220-2008 附录C (资料性附录)猪肝、猪肾、猪肉添加回收率汇总表表C.l猪肝中苯二氧卓类药物回收率数据表药物名称添加浓度/回收率/
23、%药物名称添加浓度/回收率1%(g/kg) g/kg)1. 0 79 . 096.。1. 0 59.871.6 地西洋2.0 2.0 58. 772. 9 4.0 61. 575. 5 1. 0 59. 682.。奥沙西洋2.0 2.0 66. 082. 3 4. 0 65. 681. 8 1. 0 74. 090. 6 利眠宁2.0 2.0 80. 096. 5 4.0 79. 5 100. 8 1. 0 79. 698.。阿普略仑2.0 2.0 82.097.3 4.0 86 . 5 102 .8 1. 0 74. 889.。-经基阿普瞠仑2. 0 I丰2.0 73. 594.。4.0 9
24、0. 8 10 1. 2 4.0 78. 893. 5 1. 0 90. 5101. 8 1. 0 76 . 692.。眯陪主赂仑2.0 81. 798. 5 去熔基氟拉西洋2.0 85. 099. 3 4.0 87. 697. 7 4.0 76. 899.。1. 0 8 1. 498. 4 1. 0 72. 882. 6 -经基眯略略仑2.0 81. 592. 5 三嗖仑2.0 66. 084. 5 4.0 88. 597. 2 4.0 74. 899. 8 10 SN/T 2220-2008 表C.2猪肾中苯二氮卓类药物回收率数据表药物名称添加浓度/囚收率/%药物名称添加浓度/回收率/Yo
25、g/kg)(/lg/kg) 1. 0 75. 293. 2 1. 0 65. 179. 2 地西拌2.0 82. 394. 5 氟西拌2.0 57. 580.。4. 0 85. 8 102. 1 4.0 62. 978. 5 1. 0 68. 083. 1 1. 0 62. 085.。奥沙西拌2. 0 2. 0 73. 093. 3 4.0 61. 875. 3 1. 0 79. 388. 2 利眠宁2. 0 2.0 78.796.5 4. 0 82. O98. 7 1. 0 79. 698. 8 阿普唾仑2.0 2.0 79.097.4 4. 0 84. 3 100. 8 1. 0 81.3
26、99.2 -经基阿普唾仑2.0 2.0 76. 593. 9 4.0 75 . 2 99. 1 1. 0 75 . 285.。眯时左嗖仑2. 0 2.0 81. 097. 3 4.0 79. 299. 2 1. 0 70. 497. 6 1. 0 67. 891.。-经基咪巧在电量仑2.0 83. 599.。三睡仑2.0 邸.587.。4.0 87. 897. 2 4.0 83.7100.3 II SN/T 2220-2008 表C.3猪肉中苯二氯卓类药物回收率数据表药物名称添加浓度/回收率/%药物名称添加浓度/回收率/%(g/kg) g/kg)1. 0 78. 092.。1. 0 60. 0
27、75.。地西洋2.0 90.0-95.。氟西洋2.0 62.0-70.4 4.0 90.3-101.。4.0 65.9-77.1 1. 0 72. 086.。1. 0 65.0-86.。奥沙西洋2.0 64.5-91. 5 7-氨基氟西洋2. 0 67.5-93.。4.0 76.8-85.3 4.0 68.9-80.8 1. 0 63.0-78.。1. 0 72.0-87.。和Jft民宁2.0 72.5-81.。去甲基氟西洋2.0 76.1-91. 0 4. 0 85.0-100.。4.0 88.0-100.2 1. 0 78.0-92.3 1. 0 88.1-103.3 阿普嗖仑2.0 79
28、.2-92.8 氟拉西洋2.0 72.0-93.4 4. 0 83.0-102.7 4.0 85.8-101. 3 1. 0 71.0-83.1 1. 0 77.0-95.3 -经基阿普唾仑2.0 82.0-93.4 2-经乙基氟拉西洋2.0 74.5-93.。4.0 90.7-100.8 4.0 73.8-100.3 1. 0 80.2-96.9 1. 0 77.4-95.2 咪用自唾仑2. 0 84.5-98.3 去炕基氟拉西洋2.0 82.5-96.。4.0 86.0-96.3 4.0 82.2- 10 1. 8 1. 0 77.1-94.8 1. 0 72.8-86.。-经基咪用吉唾仑2.0 83.0-94.6 三I堕仑2.0 69.5-87.3 4. 0 87.0-100.5 4.0 74.9-99.5 12
